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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】从RNA到cDNA合成再到克隆PCR的实验技巧和操作细节问题若干，寻求解答
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主

[交流] 【求助/交流】从RNA到cDNA合成再到克隆PCR的实验技巧和操作细节问题若干，寻求解答 已有4人参与

因为自己是新手，在实验室这半年来，经历了很多失败和挫折！！目前的实验进展也不算特别顺，但是已经习惯和适应。然而还是有很多实验细节的东西不懂，主要是理论知识缺乏，对其特性了解的不够。寻求达人帮助，解答我心中的疑惑，问题如下：
1．RNA保存是不是必须和DNA隔离开，以防止污染？
2．合成的RNA是不是必须等待在冰上融化，如果用手触摸使其溶化会不会有影响？到底是影响RNA的质量，还是cDNA的质量，或者两个都影响？
3．cDNA的合成和RNA的合成过程都需要戴手套，其原因是不是只在于防止人体产生的酶的污染和在PCR过程中防止将其他杂质片段错误扩增？
4．如果PCR产物经试剂盒纯化后浓度很低，在引物和其他试剂都没问题的基础上，问题是否有可能存在于cDNA加样过程中，比如PCR管里出现许多气泡，或试剂未混匀，或者加酶后没有放在冰上，没有立即P？
5．RNA和cDNA是否都很脆弱，得到的cDNA是否要轻柔对待？如果涡旋液体，会不会影响cDNA的质量，比如DNA链条变成碎片，断裂等等。

因为自己的理论背景知识实在太缺乏了，所以有些专业用词不准确，还望见谅！！！

[ Last edited by 听雪看山 on 2010-5-19 at 22:03 ]
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1楼 2010-05-19 22:02:15
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gastrodia

金虫 (正式写手)
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lstt09nk(金币+3):欢迎多多交流~~ 2010-05-20 21:48:14
RNA的保存，可以保存在水溶液中（-80，无RNase的水）或者直接以沉淀形式保存在无水乙醇或者洁净的去离子甲酰胺中，至于要不要防止污染看实验的目的而定
合成的RNA（化学合成？很奢侈），我们一般都是提取的总RNA的可以放在冰上慢慢等，也可以握在手心融合，当然要带手套，防止RNase污染，因为RNase无处不在又很难失活，
有没有立即P不是问题，至于气泡也不是问题，94度的热循环，气泡很快就没了，至于条带弱通常问题是PCR的模板不纯，或者有抑制PCR的物质存在，若使用cDNA为模板，有可能你的基因表达量很低，

涡旋会影响质量，但对于做PCR可以忽略不计，因为PCR是级联放大反应，只要有一点模板cDNA就可以扩出所需条带，但是RNA和cDNA要避免反复冻融
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2楼2010-05-19 22:18:13
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

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谢谢楼上的回答，很受用。
还有个问题：
6.在用试剂盒纯化PCR后在凝胶上的产物的时候，切下的胶要在50-65度下进行溶解，如果在这个温度下时间过长，对产量有没有影响呢？
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3楼2010-05-20 00:00:08
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
没有，加热只是促进融化胶，实际上你加了溶胶液室温放置30min到1h，胶也会融化，
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4楼2010-05-20 09:33:37
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼上的说的很全面了，实际上对于钓基因，rna的质量要求不是很高，更重要的是你的目的基因的长度，表达量，设计的引物等因素
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5楼2010-05-20 09:42:35
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

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谢谢gastrodia  和   jasco  

还有一个问题
7。怎么能够找到5‘端的基因非编码区，为什么NCBI不提供这个区域的基因序列呢？
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6楼2010-05-20 19:17:22
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gastrodia

金虫 (正式写手)
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lstt09nk(金币+1):热心虫友~~ 2010-05-20 21:48:38
RACE即可，不是NCBI不提供，而是不同的实验室在递交序列的时候有的只会递交编码区的全长，有的会递交非编码区和编码区，仅此而已，如果他们做这个基因还好，如果不做这个基因，即本基因是他们试验的副产品，有时只是一部分序列而已
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7楼2010-05-20 21:41:17
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过氧化氢

铁虫 (初入文坛)
★
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受用了
我也正在了解这个方面的
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8楼2010-05-20 22:24:00
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

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谢谢gastrodia  一如既往的替我回答问题，还有一个

8。如果cDNA克隆 连接好的载体和目的基因片段拿去测序，发现了内含子，而且连续做了很多次，其中都有内含子存在，我的克隆也因此根本不可以用，内含子里面存在太多的stop codons 。 什么原因会造成内含子的出现，有没有可能是因为从植物中提的RNA有问题？（我用来扩增目的基因的酶是高保真的，PCR的过程应该也没问题）
9。启动子是不是就是5‘端的非编码区UTR？如果不是，启动子能不能通过网络找到？（貌似动物的可以找到，植物的搜索但没结果）


PS：我的问题都比较傻，如果好好看看生物学书，自己肯定都能解答，可是基础的薄弱不是一下功夫能解决的！只能拜托这里的好心人喏！！！

[ Last edited by 听雪看山 on 2010-5-20 at 23:59 ]
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9楼2010-05-20 23:52:40
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jasco

木虫 (正式写手)
8. 这个情况多半是rna提取的时候混入了dna，在植物rna提取时很常见，建议反转录之前用dnase I消化一下
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10楼2010-05-21 10:06:01
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