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听雪看山木虫 (职业作家)
西游家族之T所长
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[交流]
【求助/交流】从RNA到cDNA合成再到克隆PCR的实验技巧和操作细节问题若干，寻求解答 已有4人参与
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因为自己是新手，在实验室这半年来，经历了很多失败和挫折！！目前的实验进展也不算特别顺，但是已经习惯和适应。然而还是有很多实验细节的东西不懂，主要是理论知识缺乏，对其特性了解的不够。寻求达人帮助，解答我心中的疑惑，问题如下： 1．RNA保存是不是必须和DNA隔离开，以防止污染？ 2．合成的RNA是不是必须等待在冰上融化，如果用手触摸使其溶化会不会有影响？到底是影响RNA的质量，还是cDNA的质量，或者两个都影响？ 3．cDNA的合成和RNA的合成过程都需要戴手套，其原因是不是只在于防止人体产生的酶的污染和在PCR过程中防止将其他杂质片段错误扩增？ 4．如果PCR产物经试剂盒纯化后浓度很低，在引物和其他试剂都没问题的基础上，问题是否有可能存在于cDNA加样过程中，比如PCR管里出现许多气泡，或试剂未混匀，或者加酶后没有放在冰上，没有立即P？ 5．RNA和cDNA是否都很脆弱，得到的cDNA是否要轻柔对待？如果涡旋液体，会不会影响cDNA的质量，比如DNA链条变成碎片，断裂等等。 因为自己的理论背景知识实在太缺乏了，所以有些专业用词不准确，还望见谅！！！ [ Last edited by 听雪看山 on 2010-5-19 at 22:03 ] |
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎多多交流~~ 2010-05-20 21:48:14
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RNA的保存，可以保存在水溶液中（-80，无RNase的水）或者直接以沉淀形式保存在无水乙醇或者洁净的去离子甲酰胺中，至于要不要防止污染看实验的目的而定 合成的RNA（化学合成？很奢侈），我们一般都是提取的总RNA的可以放在冰上慢慢等，也可以握在手心融合，当然要带手套，防止RNase污染，因为RNase无处不在又很难失活， 有没有立即P不是问题，至于气泡也不是问题，94度的热循环，气泡很快就没了，至于条带弱通常问题是PCR的模板不纯，或者有抑制PCR的物质存在，若使用cDNA为模板，有可能你的基因表达量很低， 涡旋会影响质量，但对于做PCR可以忽略不计，因为PCR是级联放大反应，只要有一点模板cDNA就可以扩出所需条带，但是RNA和cDNA要避免反复冻融 |
2楼2010-05-19 22:18:13
听雪看山
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谢谢gastrodia 一如既往的替我回答问题，还有一个 8。如果cDNA克隆 连接好的载体和目的基因片段拿去测序，发现了内含子，而且连续做了很多次，其中都有内含子存在，我的克隆也因此根本不可以用，内含子里面存在太多的stop codons 。 什么原因会造成内含子的出现，有没有可能是因为从植物中提的RNA有问题？（我用来扩增目的基因的酶是高保真的，PCR的过程应该也没问题） 9。启动子是不是就是5‘端的非编码区UTR？如果不是，启动子能不能通过网络找到？（貌似动物的可以找到，植物的搜索但没结果） PS：我的问题都比较傻，如果好好看看生物学书，自己肯定都能解答，可是基础的薄弱不是一下功夫能解决的！只能拜托这里的好心人喏！！！ [ Last edited by 听雪看山 on 2010-5-20 at 23:59 ] |
9楼2010-05-20 23:52:40
jasco
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