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听雪看山

木虫 (职业作家)

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[交流] 【求助/交流】从RNA到cDNA合成再到克隆PCR的实验技巧和操作细节问题若干，寻求解答已有4人参与

因为自己是新手，在实验室这半年来，经历了很多失败和挫折！！目前的实验进展也不算特别顺，但是已经习惯和适应。然而还是有很多实验细节的东西不懂，主要是理论知识缺乏，对其特性了解的不够。寻求达人帮助，解答我心中的疑惑，问题如下：
1．RNA保存是不是必须和DNA隔离开，以防止污染？
2．合成的RNA是不是必须等待在冰上融化，如果用手触摸使其溶化会不会有影响？到底是影响RNA的质量，还是cDNA的质量，或者两个都影响？
3．cDNA的合成和RNA的合成过程都需要戴手套，其原因是不是只在于防止人体产生的酶的污染和在PCR过程中防止将其他杂质片段错误扩增？
4．如果PCR产物经试剂盒纯化后浓度很低，在引物和其他试剂都没问题的基础上，问题是否有可能存在于cDNA加样过程中，比如PCR管里出现许多气泡，或试剂未混匀，或者加酶后没有放在冰上，没有立即P？
5．RNA和cDNA是否都很脆弱，得到的cDNA是否要轻柔对待？如果涡旋液体，会不会影响cDNA的质量，比如DNA链条变成碎片，断裂等等。

因为自己的理论背景知识实在太缺乏了，所以有些专业用词不准确，还望见谅！！！

[ Last edited by 听雪看山 on 2010-5-19 at 22:03 ]

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开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。

1楼 2010-05-19 22:02:15

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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

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谢谢楼上的回答，很受用。
还有个问题：
6.在用试剂盒纯化PCR后在凝胶上的产物的时候，切下的胶要在50-65度下进行溶解，如果在这个温度下时间过长，对产量有没有影响呢？

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开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。

3楼2010-05-20 00:00:08

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gastrodia

金虫 (正式写手)

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★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎多多交流~~ 2010-05-20 21:48:14

RNA的保存，可以保存在水溶液中（-80，无RNase的水）或者直接以沉淀形式保存在无水乙醇或者洁净的去离子甲酰胺中，至于要不要防止污染看实验的目的而定
合成的RNA（化学合成？很奢侈），我们一般都是提取的总RNA的可以放在冰上慢慢等，也可以握在手心融合，当然要带手套，防止RNase污染，因为RNase无处不在又很难失活，
有没有立即P不是问题，至于气泡也不是问题，94度的热循环，气泡很快就没了，至于条带弱通常问题是PCR的模板不纯，或者有抑制PCR的物质存在，若使用cDNA为模板，有可能你的基因表达量很低，

涡旋会影响质量，但对于做PCR可以忽略不计，因为PCR是级联放大反应，只要有一点模板cDNA就可以扩出所需条带，但是RNA和cDNA要避免反复冻融

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2楼2010-05-19 22:18:13

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