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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：约6kb质粒做模板的pcr程序怎么设定啊
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huichong

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助：约6kb质粒做模板的pcr程序怎么设定啊

我的质粒约6kb，做模板一直p不出来，我的酶是fermentas的dream taq 酶，请各位指教一下，看看怎么设置pcr程序啊
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1楼2012-03-05 17:34:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

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PCR用质粒做模板，一个反应有10-100 ng就够了。但我觉得模板浓度高低顶多影响结果好坏，不会对是否能P出条带产生影响。所以楼主的问题不一定是模板浓度，PCR程序上会不会有问题？譬如说产物有多大，每个循环延伸时间是否足够？
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
3楼2012-03-06 01:00:19
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-03-06 11:03:20
我觉得还是退火温度和镁离子浓度最为重要，先优化一下再说。你的片段有6KB，有点长，不知道你的酶适不适合做长片段的PCR。延伸时间1kb/min即可，如果楼主觉得优化条件太麻烦，也不妨直接换引物来做。
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4楼2012-03-06 09:11:36
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wenwen4599

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
6 kb的长度一般的酶已经很难扩出来了，建议先按照楼上几位说的优化条件，如果还是不行建议换拉长片段的酶，TAKARA的LA，还有东洋坊KOD都不错。
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5楼2012-03-06 09:35:54
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bst5

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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各位大神忽略了一个问题，就是模板的浓度，如果你是kit提的质粒，建议测一下浓度，浓度太高也会影响pcr的，个人愚见。
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9楼2012-03-06 17:16:41
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普通回帖

younger123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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会不会是你引物的问题，或者你做个梯度pcr，找出最合适的退火温度，要不然就换一种酶来尝试一下吧，又可能换了一种酶后就可以p出来了，程序在说明书上会有的吧。
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2楼2012-03-05 23:14:43
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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你可以试试TDPCR或者梯度PCR，如果P不出来，可以分段PCR在连接起来嘛
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6楼2012-03-06 09:46:33
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麻花13

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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这取决于你目的基因的长短，而不是质粒的大小，当然，要注意引物与质粒是否有非特异性结合
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7楼2012-03-06 10:25:25
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niushuaiji

金虫 (正式写手)

不放弃的小鸟

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首先是高保真酶，其次，梯度pcr寻找最适Tm，再次加长变性和延伸时间，为保证足够的酶活可以试着反应中间再次加酶
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Tobeornottobe,that'saproblem
8楼2012-03-06 10:42:46
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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质粒作为模板，大小没有很大的关系。要确定的是你要P出的片段是多大，设置延伸时间，计算出引物的Tm值来确定退货温度，还有查找正反引物之间是否形成引物二聚体。还有PCR各种溶液是否能用。总之，PCR做不出的原因很多，需要一项一项的排除。
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10楼2012-03-06 18:02:43
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