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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】做连接后的质粒是否可以用来做pcr
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manman424

禁虫 (初入文坛)
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1楼2011-01-12 10:48:06
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xulanzzz

金虫 (著名写手)
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rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-12 15:56:38
连接的产物可以直接PCR来验证是否连接成功，但是唯一的问题就是若仅有一点连接成功的话就可以PCR出阳性结果，但是能否转化成功就有很多因素，比如感受态效率等等，连接产物PCR就以连接产物做模板，模板量1微升足够，常规PCR即可。。。
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DOBEST
2楼2011-01-12 10:52:11
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
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rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-12 15:56:43
可以直接作为PCR模板的，有的人推荐单酶切处理后作模板。
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3楼2011-01-12 15:52:34
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
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为啥还要酶切质粒 再连接呢  直接pcr 不就行么
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2011-01-12 18:46:30
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manman424

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5楼2011-01-13 09:08:12
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manman424

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6楼2011-01-13 09:09:08
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manman424

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7楼2011-01-13 09:10:33
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xulanzzz

金虫 (著名写手)
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rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:09:44
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Originally posted by manman424 at 2011-01-13 09:08:12:




谢谢了，还有点问题想请教你，昨天对连接液进行了电泳检测，从6000多bp到2000多bp都有条带，因为我的目的质粒（大小在2000bp左右）原来是单酶切EcoRI处理过的，因该是出现了自连，两个或三个连接在一起， ...

连接液电泳检测很明显是不明智的，毕竟只要有连接上的，转化效率够好就能够挑出转化子，但是跑电泳少量的连接上的肯定是看不见的。再说你用的是单酶切，就有很多自连发生，挑转化子还是比较困难的。。。。

[ Last edited by xulanzzz on 2011-1-13 at 09:24 ]
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DOBEST
8楼2011-01-13 09:23:48
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manman424

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9楼2011-01-13 10:07:41
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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引用回帖:
Originally posted by manman424 at 2011-01-13 09:09:08:



因为要保证目的质粒的完整性，否则pcr时p出的东西不能用

说句实话完全没有必要的   话说我从来都是直接从质粒上pcr的  我现在构建了快100多个质粒了 没有问题!
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
10楼2011-01-13 11:41:00
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