应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌落PCR无条带
201/2返回列表12下一页
查看: 5652  |  回复: 19
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR无条带

双酶切T载体和表达载体后，回收获得目的片段和载体，连接，转化，挑18个单克隆，菌落PCR全部无条带，这是怎么回事，目的片段确定酶切成功，表达载体无法从电泳图上确定是否两个位点都酶切成功（两个酶切位点紧连着）。可能是什么原因呢？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-12-19 19:02:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

panda73

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！ 2011-12-22 18:35:56
载体的处理很重要，你如果不确定载体是否处理完全，可以在做双酶切时，设置类似的单酶切对照，根据质粒带型的变化确定是否在双酶切体系中，两个酶都正常工作了。另外，双酶切时，加的酶量很重要，多了容易star activity，而加少了，容易导致酶切不完全，连接时出现大量的载体自连，克隆效率很低。根据酶单位的定义，可以大致推算出酶切一定量的质粒DNA应该加多少酶量。有些专门计算双酶切是酶用量的软件。
赞一下(2人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

笔冰河
9楼2011-12-20 21:41:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

xhy0016

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
笔冰河(金币+1): 2011-12-20 14:40:56
你为什么不提质粒跑电泳验证一下，而非要直接菌落PCR呢
赞一下 回复此楼
2楼2011-12-19 19:09:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

笔冰河

银虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 我也觉得~ 2011-12-27 17:25:42
引用回帖:
楼: Originally posted by xhy0016 at 2011-12-19 19:09:00:
你为什么不提质粒跑电泳验证一下，而非要直接菌落PCR呢

一般不是都先菌落PCR吗，几十个菌落，提质粒成本太高了，而且还需要过夜摇菌
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-12-20 08:35:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
笔冰河(金币+1): 去磷酸化的条件是什么呢，要自己配溶液吗，还是有试剂盒买 2011-12-20 14:40:34
西瓜(金币+3): Good 2011-12-22 18:34:35
有这么多假阳性？一般我连接载体，阳性率高于90%。只有当PCR直接酶切时候，有部份结果连接错误。所以我觉的还是酶切不完全吧。菌液PCR有做对照吗？如果是阳性一般都有条带。楼主如果不想更改酶切体系，可以试试去磷酸化。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-12-20 09:03:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励应助！很久不见了哈~ 2011-12-22 18:35:06
菌落PCR太不可靠，我一般摇菌提质粒，质粒跑电泳大小合适的话，再做酶切验证，溶液ⅠⅡⅢ都是自己配的，实验都是很麻烦，想走捷径，就有不确定性。祝实验顺利。
赞一下(1人) 回复此楼
生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
5楼2011-12-20 10:21:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiying198509

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-12-22 18:35:21
可以试试提几个菌的质粒 测一下DNA浓度 如果正常的话 可以做酶切验证不过如果菌落全部正确的话 这可能性很小 建议重新连接
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-12-20 13:25:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

笔冰河

银虫 (小有名气)
降低了退火温度，增加了5个循环，重新挑12个单克隆，全部都有条带，但是很淡，是不是假阳性的概率比较高啊
赞一下 回复此楼
7楼2011-12-20 18:59:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): good 2011-12-22 18:35:45
一般条件下，菌液PCR应该很浓的，不会那么淡，但是可以提质粒看看，去磷酸化的酶公司都有卖，就提醒一点，反应完后千万别按说明书说的去抽提纯化，可以直接用反应液连接
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2011-12-20 20:27:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

笔冰河

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by panda73 at 2011-12-20 21:41:26:
载体的处理很重要，你如果不确定载体是否处理完全，可以在做双酶切时，设置类似的单酶切对照，根据质粒带型的变化确定是否在双酶切体系中，两个酶都正常工作了。另外，双酶切时，加的酶量很重要，多了容易star ac ...

谢谢！
回复此楼
10楼2011-12-21 19:38:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 笔冰河 的主题更新
201/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +9 Ldrop2023 2026-08-13 9/450 2026-08-16 13:24 by wukun_007
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +11 家与远方 2026-08-10 16/800 2026-08-16 10:28 by ray43
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +6 wangze12014 2026-08-14 7/350 2026-08-15 20:12 by gltch
[基金申请] filecode +8 cratir 2026-08-14 12/600 2026-08-15 18:08 by zyfgau
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +12 Tide man 2026-08-10 13/650 2026-08-15 16:34 by 氺木
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +10 majunge000 2026-08-10 13/650 2026-08-15 12:26 by hanpeng972
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭