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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】菌落PCR扩出来的片段不是目的片段，咋办啊？？？？
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】菌落PCR扩出来的片段不是目的片段，咋办啊？？？？已有6人参与

今天两次菌落PCR，扩出来的片段都不是目的片段。最初P的是菌的16S，用的是通用引物27F和1492R，扩出来1500bp左右的16S片段，然后将PCR产物切胶回收纯化，并且已检测了回收产物，是1500左右。然后做连接，连接到pMD19—T载体上，转化JM109感受态，次日，平板上长出菌落，白斑居多，蓝斑数个，挑取白斑做菌落PCR，引物用M13，电泳检测PCR产物，条带居然在500bP处！！！吓我一跳！我做了两次了，两次一共挑了19个白斑了，扩出来都是500bp的。怎么回事啊这是？？？？？请大侠们解释一下。感激涕零！！！！
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1楼2010-12-14 21:02:33
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waiwaidou_1983

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+5):鼓励积极参与~~~ 2010-12-14 22:25:24
大肠杆菌中也有16S，你的引物可能扩出的是宿主菌的16S， 不是你插入的目的片段
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2楼2010-12-14 21:15:54
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by waiwaidou_1983 at 2010-12-14 21:15:54:
大肠杆菌中也有16S，你的引物可能扩出的是宿主菌的16S， 不是你插入的目的片段

可我用的是M13引物啊，这不是针对载体的吗？怎么会扩出大肠杆菌的基因？
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3楼2010-12-14 21:54:00
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-12-17 11:14:29
引用回帖:
Originally posted by 梦想起飞 at 2010-12-14 21:02:33:
今天两次菌落PCR，扩出来的片段都不是目的片段。最初P的是菌的16S，用的是通用引物27F和1492R，扩出来1500bp左右的16S片段，然后将PCR产物切胶回收纯化，并且已检测了回收产物，是1500左右。然后做连接，连接到pM ...

做16s你还菌落pcr，你想干嘛？验证有没有连上？没必要啊，跑电泳大小对了就行了，根本不用验证。。。
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小木虫之有关部门负责人
4楼2010-12-14 21:59:29
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五柳

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-12-14 21:59:29:

做16s你还菌落pcr，你想干嘛？验证有没有连上？没必要啊，跑电泳大小对了就行了，根本不用验证。。。

同意楼上
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5楼2010-12-14 22:04:12
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可能是你这个T载体假阳性太高了吧，你选几个蓝斑试试吧，蓝白斑筛选有的时候很不靠谱！
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6楼2010-12-14 22:20:01
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-12-14 21:59:29:

做16s你还菌落pcr，你想干嘛？验证有没有连上？没必要啊，跑电泳大小对了就行了，根本不用验证。。。

我是要测序啊，转化之后蓝白斑筛选，但是白色不是也有假阳性吗？想挑菌做菌落pcr，片段正确的话就挑相应菌落摇菌测序啊。不是这样的吗？
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7楼2010-12-15 20:56:59
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ganchao1776 at 2010-12-14 22:20:01:
可能是你这个T载体假阳性太高了吧，你选几个蓝斑试试吧，蓝白斑筛选有的时候很不靠谱！

是吗？我今天也想挑个蓝斑来着，可是做实验是时候糊涂了，还是没挑。不过我又用目的片段的引物扩增了白斑菌落，结果是1500。晕啊！彻底晕了
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8楼2010-12-15 20:59:43
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
通用引物退火要在58度以上，就不会扩出乱七八糟的带了。
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生命不息，探索不止。
9楼2010-12-15 22:37:32
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by Arrennew at 2010-12-15 22:37:32:
通用引物退火要在58度以上，就不会扩出乱七八糟的带了。

是吗？这么高啊？好吧……谢谢交流啊！
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10楼2010-12-17 10:13:37
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