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梦想起飞

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】菌落PCR扩出来的片段不是目的片段,咋办啊???? 已有6人参与

今天两次菌落PCR,扩出来的片段都不是目的片段。最初P的是菌的16S,用的是通用引物27F和1492R,扩出来1500bp左右的16S片段,然后将PCR产物切胶回收纯化,并且已检测了回收产物,是1500左右。然后做连接,连接到pMD19—T载体上,转化JM109感受态,次日,平板上长出菌落,白斑居多,蓝斑数个,挑取白斑做菌落PCR,引物用M13,电泳检测PCR产物,条带居然在500bP处!!!吓我一跳!我做了两次了,两次一共挑了19个白斑了,扩出来都是500bp的。怎么回事啊这是?????请大侠们解释一下。感激涕零!!!!
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可能是你这个T载体假阳性太高了吧,你选几个蓝斑试试吧,蓝白斑筛选有的时候很不靠谱!
6楼2010-12-14 22:20:01
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waiwaidou_1983

铜虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
rainwander(金币+5):鼓励积极参与~~~ 2010-12-14 22:25:24
大肠杆菌中也有16S,你的引物可能扩出的是宿主菌的16S, 不是你插入的目的片段
2楼2010-12-14 21:15:54
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by waiwaidou_1983 at 2010-12-14 21:15:54:
大肠杆菌中也有16S,你的引物可能扩出的是宿主菌的16S, 不是你插入的目的片段

可我用的是M13引物啊,这不是针对载体的吗?怎么会扩出大肠杆菌的基因?
3楼2010-12-14 21:54:00
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-12-17 11:14:29
引用回帖:
Originally posted by 梦想起飞 at 2010-12-14 21:02:33:
今天两次菌落PCR,扩出来的片段都不是目的片段。最初P的是菌的16S,用的是通用引物27F和1492R,扩出来1500bp左右的16S片段,然后将PCR产物切胶回收纯化,并且已检测了回收产物,是1500左右。然后做连接,连接到pM ...

做16s你还菌落pcr,你想干嘛?验证有没有连上?没必要啊,跑电泳大小对了就行了,根本不用验证。。。
小木虫之有关部门负责人
4楼2010-12-14 21:59:29
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