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zxyjenny6

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】5500bp的片段PCR问题已有18人参与

各位大侠:本人最近在做一段5500bp的目的基因的PCR,采用的是takara的EX TAQ酶,选择的引物应该没有问题,按照相关原则设定了反应条件,并且在此基础上稍作改变尝试了几次,但都没有P出来。想请问各位,有没有什么好的建议或者应该怎样改进反应条件,能把我要的目的基因P出来。O(∩_∩)O谢谢!
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

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1949stone(金币+1): 2010-04-25 13:11
设计的引物稍长点 循环次数减短
仕不可不弘毅,任重而道远
4楼2010-04-24 16:52:38
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普通回帖

shengwufenzi

金虫 (正式写手)

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1949stone(金币+2): 2010-04-25 13:11
你做的片段有些大,肯定不好做的。再有一方法是先扩增此基因的一部分片段,再酶切后做反向PCR,不过难度也是挺大的,实在不行,你可以试试
2楼2010-04-24 16:22:48
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gastrodia

金虫 (正式写手)

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1949stone(金币+1): 2010-04-25 13:11
扩增长片段的时候,你的模板一定要纯,
3楼2010-04-24 16:52:30
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luizing

银虫 (正式写手)


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做的片段太大
要多摸索条件
知识改变命运
5楼2010-04-24 17:02:11
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308145157

木虫 (著名写手)

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1949stone(金币+2): 2010-04-25 13:11
试试换个酶吧,用过KOD-FX东洋纺的,这个酶扩5k多的片段还是很轻松的,据说最多做到过1w7k,我用来P过7k的一点问题没有。
心若在,梦就在......
6楼2010-04-24 17:23:01
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阿娇

金虫 (正式写手)

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1949stone(金币+2): 2010-04-25 13:11
你扩的片段太长,72度延伸时间应该延长。平常小片段是30s到1min。我扩4kbp的用3min。也是用Takara的酶,你扩5k多的应该要4min吧。可能3min也行了。祝你成功
7楼2010-04-24 20:22:48
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yuanfeng

金虫 (小有名气)

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1949stone(金币+2): 2010-04-25 13:12
扩的片段太长了吧,扩长片段我们一般用的是trans的fastpfu,一般20s 1Kb,5.5kb延伸2min应该足够了,而且保真性很好。条件就是一般的条件,我们做过以保存的菌液做模板p4kb的基因,效果很好的。
8楼2010-04-24 21:24:22
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上

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1949stone(金币+3): 2010-04-25 13:12
以前扩6K的片段用的是一种高延展的酶,哪家公司的我给忘了。
保真性如何不清楚,没测过序,因为只是做检测
一开始没扩出来,后来发现是提取的细菌总DNA不够好,可能是有机试剂没去干净
最后往体系里加了点DMSO就出来了
终于熬成木虫了……
9楼2010-04-25 07:35:37
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zxyjenny6

新虫 (小有名气)

1949stone:祝你成功 2010-04-25 13:12
我用的引物已经挺长了,加上酶切位和保护碱基都快40了,只不过用的模板不是提取的DNA,因为以前P别的时候都可以直接挑菌就可以了。延伸的时间也足够长,而EX TAQ貌似也是高保真的,看来只能先多试试了,实在不行再考虑换酶了。谢谢大家了哈
10楼2010-04-25 12:52:50
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