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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】5500bp的片段PCR问题
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zxyjenny6

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】5500bp的片段PCR问题 已有18人参与

各位大侠：本人最近在做一段5500bp的目的基因的PCR，采用的是takara的EX TAQ酶，选择的引物应该没有问题，按照相关原则设定了反应条件，并且在此基础上稍作改变尝试了几次，但都没有P出来。想请问各位，有没有什么好的建议或者应该怎样改进反应条件，能把我要的目的基因P出来。O(∩_∩)O谢谢！
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1楼 2010-04-24 15:25:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
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1949stone(金币+1): 2010-04-25 13:11
设计的引物稍长点 循环次数减短
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仕不可不弘毅，任重而道远
4楼2010-04-24 16:52:38
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普通回帖

shengwufenzi

金虫 (正式写手)
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1949stone(金币+2): 2010-04-25 13:11
你做的片段有些大，肯定不好做的。再有一方法是先扩增此基因的一部分片段，再酶切后做反向PCR，不过难度也是挺大的，实在不行，你可以试试
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2楼2010-04-24 16:22:48
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gastrodia

金虫 (正式写手)
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1949stone(金币+1): 2010-04-25 13:11
扩增长片段的时候，你的模板一定要纯，
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3楼2010-04-24 16:52:30
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luizing

银虫 (正式写手)
★
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做的片段太大
要多摸索条件
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知识改变命运
5楼2010-04-24 17:02:11
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308145157

木虫 (著名写手)
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1949stone(金币+2): 2010-04-25 13:11
试试换个酶吧，用过KOD-FX东洋纺的，这个酶扩5k多的片段还是很轻松的，据说最多做到过1w7k，我用来P过7k的一点问题没有。
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心若在，梦就在......
6楼2010-04-24 17:23:01
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阿娇

金虫 (正式写手)
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1949stone(金币+2): 2010-04-25 13:11
你扩的片段太长，72度延伸时间应该延长。平常小片段是30s到1min。我扩4kbp的用3min。也是用Takara的酶，你扩5k多的应该要4min吧。可能3min也行了。祝你成功
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7楼2010-04-24 20:22:48
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
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1949stone(金币+2): 2010-04-25 13:12
扩的片段太长了吧，扩长片段我们一般用的是trans的fastpfu，一般20s 1Kb，5.5kb延伸2min应该足够了，而且保真性很好。条件就是一般的条件，我们做过以保存的菌液做模板p4kb的基因，效果很好的。
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8楼2010-04-24 21:24:22
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
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1949stone(金币+3): 2010-04-25 13:12
以前扩6K的片段用的是一种高延展的酶，哪家公司的我给忘了。
保真性如何不清楚，没测过序，因为只是做检测
一开始没扩出来，后来发现是提取的细菌总DNA不够好，可能是有机试剂没去干净
最后往体系里加了点DMSO就出来了
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终于熬成木虫了……
9楼2010-04-25 07:35:37
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zxyjenny6

新虫 (小有名气)
1949stone:祝你成功 2010-04-25 13:12
我用的引物已经挺长了，加上酶切位和保护碱基都快40了，只不过用的模板不是提取的DNA，因为以前P别的时候都可以直接挑菌就可以了。延伸的时间也足够长，而EX TAQ貌似也是高保真的，看来只能先多试试了，实在不行再考虑换酶了。谢谢大家了哈
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10楼2010-04-25 12:52:50
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