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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】5500bp的片段PCR问题
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+2):辛苦~~~ 2010-04-26 17:13
我都快扩了一年的10KB的全长，用的是宝生物LA Taq，酶都用N支，有时候能扩出来，有时候又扩不出来，以前都是用cDNA扩的，不过非特异带很多，目的带的量也很少。最近试了两次用回收的产物再次P，好像有扩出来，不过非特异带照样有，而且量更少了，以前我是从未P出来过。搞了这么久，也没总结出现什么经验，有一点是肯定的：长片段的确难扩！最近我在全长两端加上几百bp的片段，又搞了快一个月了，基本上每天P一次，我都要快崩溃了。老板还老说老子不努力，想到要毕业，我就想骂人。兄弟，没事儿的5K的肯定没问题的，努把力。望早日成功！
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11楼2010-04-25 15:43:57
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zxyjenny6

新虫 (小有名气)
呵呵，看来你比我更头疼啊。我这才刚开始做呢，这个P不出来后面的没法做啊，而且P一次时间又很长，每次都是等了半天出不了结果，郁闷的积极性都没了。对了，你的条件是怎样的啊？我看到貌似有的人说长片段PCR要用两步法，可是我的退火温度为55℃时就只有引物二聚体了，其他啥都没……
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12楼2010-04-26 13:44:45
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
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scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-26 17:13
我用  takara 的 ex  。。最多扩过6k的片段。。 延伸温度一定要长。  这个酶是可以做到这么长的的
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13楼2010-04-26 14:19:51
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zxyjenny6

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-04-26 14:19:51:
我用  takara 的 ex  。。最多扩过6k的片段。。 延伸温度一定要长。  这个酶是可以做到这么长的的

呵呵，延伸温度要高还是延伸时间要长？方便透露一下条件吗？
                                 非常感谢
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14楼2010-04-26 16:16:03
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zhaorr

铁虫 (小有名气)
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加油，呵呵
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愿你生命中的每一天都快乐
15楼2010-04-26 18:57:10
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
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用重叠PCR好了，中间设计一个引物～分开P
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16楼2010-04-27 15:46:37
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375050424

银虫 (小有名气)
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用Takara的LA taq酶和buffer应该没问题，72度延伸6min左右
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17楼2010-04-27 16:26:57
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用 LA的酶 最多可以扩 8k的片段。很稳
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18楼2010-05-05 20:40:06
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cnb1987

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
291688楼: Originally posted by 墨香若水 at 2010-04-24 16:52:38
设计的引物稍长点 循环次数减短

引物稍长些？30bp怎么样?
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19楼2012-10-29 14:20:19
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biopanda

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
1274641楼: Originally posted by cnb1987 at 2012-10-29 14:20:19
引物稍长些？30bp怎么样?...

30bp不短
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仕不可不弘毅，任重而道远。
20楼2012-10-30 13:01:53
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