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zxyjenny6

新虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】5500bp的片段PCR问题已有18人参与

各位大侠：本人最近在做一段5500bp的目的基因的PCR，采用的是takara的EX TAQ酶，选择的引物应该没有问题，按照相关原则设定了反应条件，并且在此基础上稍作改变尝试了几次，但都没有P出来。想请问各位，有没有什么好的建议或者应该怎样改进反应条件，能把我要的目的基因P出来。O(∩_∩)O谢谢！

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1楼2010-04-24 15:25:22

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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

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性别: GG
专业: 生物化学

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+2):辛苦~~~ 2010-04-26 17:13

我都快扩了一年的10KB的全长，用的是宝生物LA Taq，酶都用N支，有时候能扩出来，有时候又扩不出来，以前都是用cDNA扩的，不过非特异带很多，目的带的量也很少。最近试了两次用回收的产物再次P，好像有扩出来，不过非特异带照样有，而且量更少了，以前我是从未P出来过。搞了这么久，也没总结出现什么经验，有一点是肯定的：长片段的确难扩！最近我在全长两端加上几百bp的片段，又搞了快一个月了，基本上每天P一次，我都要快崩溃了。老板还老说老子不努力，想到要毕业，我就想骂人。兄弟，没事儿的5K的肯定没问题的，努把力。望早日成功！