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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】5500bp的片段PCR问题
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zxyjenny6

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】5500bp的片段PCR问题 已有18人参与

各位大侠：本人最近在做一段5500bp的目的基因的PCR，采用的是takara的EX TAQ酶，选择的引物应该没有问题，按照相关原则设定了反应条件，并且在此基础上稍作改变尝试了几次，但都没有P出来。想请问各位，有没有什么好的建议或者应该怎样改进反应条件，能把我要的目的基因P出来。O(∩_∩)O谢谢！
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1楼 2010-04-24 15:25:22
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zxyjenny6

新虫 (小有名气)
呵呵，看来你比我更头疼啊。我这才刚开始做呢，这个P不出来后面的没法做啊，而且P一次时间又很长，每次都是等了半天出不了结果，郁闷的积极性都没了。对了，你的条件是怎样的啊？我看到貌似有的人说长片段PCR要用两步法，可是我的退火温度为55℃时就只有引物二聚体了，其他啥都没……
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12楼2010-04-26 13:44:45
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shengwufenzi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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1949stone(金币+2): 2010-04-25 13:11
你做的片段有些大，肯定不好做的。再有一方法是先扩增此基因的一部分片段，再酶切后做反向PCR，不过难度也是挺大的，实在不行，你可以试试
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2楼2010-04-24 16:22:48
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★
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1949stone(金币+1): 2010-04-25 13:11
扩增长片段的时候，你的模板一定要纯，
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3楼2010-04-24 16:52:30
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
★ ★
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1949stone(金币+1): 2010-04-25 13:11
设计的引物稍长点 循环次数减短
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仕不可不弘毅，任重而道远
4楼2010-04-24 16:52:38
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