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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】菌落PCR问题
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竹林江南

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】菌落PCR问题

问一下，我想构建16s rRNA基因文库。DNA提取、PCR扩增（引物27f，1492r，产生片段约1500bp）纯化都没有问题，连接载体pMDT19，连接后转化、涂布平板有单克隆出来，但做菌落PCR时最多只有200bp的结果出来，是什么原因呢？
构建另外一个目的基因克隆文库，同样的操作步骤，只是另外一对引物扩增出的是500bp产物，克隆后菌落pcr能够成功。
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1楼 2011-01-18 15:57:23
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犹寒

铁虫 (初入文坛)
竹林江南(金币+1): 2011-01-19 13:45:05
引用回帖:
Originally posted by 竹林江南 at 2011-01-18 15:57:23:
问一下，我想构建16s rRNA基因文库。DNA提取、PCR扩增（引物27f，1492r，产生片段约1500bp）纯化都没有问题，连接载体pMDT19，连接后转化、涂布平板有单克隆出来，但做菌落PCR时最多只有200bp的结果出来，是什么原 ...

我的也出现问题了，克隆出来，也pcr出来了条带，只是测不出序，很是郁闷。另外，引物27f，和1492r是什么引物，通用引物吗？主要p什么菌的？你的菌落PCR是怎么做的呢？有没有非特异性条带出现呢？
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2楼2011-01-19 10:20:15
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我叫路人甲

银虫 (小有名气)
你的菌落PCR的引物是什么呢？
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3楼2011-01-23 17:41:18
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zgb1982

木虫 (正式写手)
看下头像
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4楼2011-01-23 18:35:39
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ureyguo

木虫 (正式写手)
竹林江南(金币+2): 2011-08-18 10:20:12
连接效率的问题，换换连接体系条件试试。
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5楼2011-03-03 17:26:43
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kingleo99

木虫 (小有名气)
竹林江南(金币+3): 2011-08-18 10:20:40
你的菌落PCR几乎都是假阳性片段，建议可以使用上下游引物P47和P48，扩增出的是1700bp 包括载体上的200bp。载体自连接估计在200左右。要么是你的连接效率太低，如果是这样那最好别筛了重新转化吧
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6楼2011-03-03 18:10:57
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
竹林江南(金币+2): 2011-08-18 10:21:07
200多 是载体自连。说明转化效率低。 换载体
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7楼2011-03-03 19:55:13
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shicaozhu

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
T载很少有自连的，可能是16S片段不纯，建议PCR产物切胶回收后再连T载。
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8楼2012-04-07 13:38:07
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