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ymzfeng

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】菌落PCR问题 已有15人参与

最近比较郁闷,将构建一个基因的表达载体,用的载体是PBI121,转化大肠杆菌后,菌落PCR检测有阳性菌落,用空的PBI121做对照的没有检测到目的片段,但是提质粒后进行PCR和BamH1和Xba1双酶切检测都没有结果,反复做了几次都是这样。
是不是我的目的片段转化进了大肠杆菌基因组中,但并没有和PBI121载体连接上,从而造成了这种情况?
有哪位知道不?谢谢
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louli

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
质粒跑的带怎么样啊!如果PCR都没检测到,证明是假阳性。至于酶切可以缩短时间再看看
2楼2010-08-04 06:51:07
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darcy2010

铜虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
scelab(金币+1):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-08-04 09:03:53
有可能是假阳性 。
Don'tletanyoneputfareintoyou!
3楼2010-08-04 08:50:51
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maggie3277

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我也是的,连接pmd18T载体,抽提质粒可以看到长度貌似是将目的片段连接上了,而且用质粒pcr可以看到目标条带,但是酶切却切不开。
4楼2010-08-04 09:18:53
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jjlbest

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
以前遇到过这种情况,是假阳性,菌落PCR很容易出现假阳性的,酶切的结果是最有力的,估计是连接有问题,可重新连接转化。
5楼2010-08-04 09:24:09
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njauzx

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
酶切位点出问题了?
引用回帖:
Originally posted by maggie3277 at 2010-08-04 09:18:53:
我也是的,连接pmd18T载体,抽提质粒可以看到长度貌似是将目的片段连接上了,而且用质粒pcr可以看到目标条带,但是酶切却切不开。

6楼2010-08-04 09:36:34
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sqhnsd

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果质粒PCR结果为阴性可以这样分析:agrose gel 电泳检查质粒提取质量,如果有质粒条带,很大可能是引物合成有问题导致酶切位点,你可以测序看看。
7楼2010-08-04 09:50:28
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周_yan

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可能是酶切出现了问题,XbaI 容易出现甲基化,使得酶切不开,但能筛出来。你应该进行一下测序,检测一下这个酶切位点是否出现问题。
8楼2010-08-04 10:26:54
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ymzfeng

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by louli at 2010-08-04 06:51:07:
质粒跑的带怎么样啊!如果PCR都没检测到,证明是假阳性。至于酶切可以缩短时间再看看

质粒跑出的是两条带,跑得慢那条明亮,另一条较暗些
9楼2010-08-04 10:43:01
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ymzfeng

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by jjlbest at 2010-08-04 09:24:09:
以前遇到过这种情况,是假阳性,菌落PCR很容易出现假阳性的,酶切的结果是最有力的,估计是连接有问题,可重新连接转化。

好的,谢谢了
10楼2010-08-04 10:44:30
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