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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】菌落PCR问题
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ymzfeng

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】菌落PCR问题 已有15人参与

最近比较郁闷，将构建一个基因的表达载体，用的载体是PBI121，转化大肠杆菌后，菌落PCR检测有阳性菌落，用空的PBI121做对照的没有检测到目的片段，但是提质粒后进行PCR和BamH1和Xba1双酶切检测都没有结果，反复做了几次都是这样。
是不是我的目的片段转化进了大肠杆菌基因组中，但并没有和PBI121载体连接上，从而造成了这种情况？
有哪位知道不？谢谢
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1楼 2010-08-03 21:46:35
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louli

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
质粒跑的带怎么样啊！如果PCR都没检测到，证明是假阳性。至于酶切可以缩短时间再看看
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2楼2010-08-04 06:51:07
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darcy2010

铜虫 (正式写手)
★ ★
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scelab(金币+1):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-08-04 09:03:53
有可能是假阳性 。
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Don'tletanyoneputfareintoyou!
3楼2010-08-04 08:50:51
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maggie3277

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也是的，连接pmd18T载体，抽提质粒可以看到长度貌似是将目的片段连接上了，而且用质粒pcr可以看到目标条带，但是酶切却切不开。
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4楼2010-08-04 09:18:53
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jjlbest

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
以前遇到过这种情况，是假阳性，菌落PCR很容易出现假阳性的，酶切的结果是最有力的，估计是连接有问题，可重新连接转化。
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5楼2010-08-04 09:24:09
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njauzx

金虫 (小有名气)
★
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酶切位点出问题了？
引用回帖:
Originally posted by maggie3277 at 2010-08-04 09:18:53:
我也是的，连接pmd18T载体，抽提质粒可以看到长度貌似是将目的片段连接上了，而且用质粒pcr可以看到目标条带，但是酶切却切不开。

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6楼2010-08-04 09:36:34
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果质粒PCR结果为阴性可以这样分析：agrose gel 电泳检查质粒提取质量，如果有质粒条带，很大可能是引物合成有问题导致酶切位点，你可以测序看看。
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7楼2010-08-04 09:50:28
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周_yan

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可能是酶切出现了问题，XbaI 容易出现甲基化，使得酶切不开，但能筛出来。你应该进行一下测序，检测一下这个酶切位点是否出现问题。
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8楼2010-08-04 10:26:54
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ymzfeng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by louli at 2010-08-04 06:51:07:
质粒跑的带怎么样啊！如果PCR都没检测到，证明是假阳性。至于酶切可以缩短时间再看看

质粒跑出的是两条带，跑得慢那条明亮，另一条较暗些
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9楼2010-08-04 10:43:01
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ymzfeng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jjlbest at 2010-08-04 09:24:09:
以前遇到过这种情况，是假阳性，菌落PCR很容易出现假阳性的，酶切的结果是最有力的，估计是连接有问题，可重新连接转化。

好的，谢谢了
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10楼2010-08-04 10:44:30
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