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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】菌落PCR问题
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ymzfeng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 周_yan at 2010-08-04 10:26:54:
可能是酶切出现了问题，XbaI 容易出现甲基化，使得酶切不开，但能筛出来。你应该进行一下测序，检测一下这个酶切位点是否出现问题。

谢谢提醒，可质粒PCR都跑步出来，就没想去测序了
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11楼2010-08-04 10:47:24
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
个人认为菌落PCR有结果的话，应该是阳性了。测序看看很有必要。也正好看看酶切位点是否正确。
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12楼2010-08-04 11:55:12
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zhchch007

禁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
本帖内容被屏蔽
13楼2010-08-04 12:04:55
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ymzfeng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-04 11:55:12:
个人认为菌落PCR有结果的话，应该是阳性了。测序看看很有必要。也正好看看酶切位点是否正确。

谢谢你！
可为什么质粒PCR却没有了，这很头疼
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14楼2010-08-04 12:10:16
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chenqi8338

铜虫 (正式写手)
我觉得做菌落PCR不如做质粒快速检测方便些！
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15楼2010-08-04 17:23:33
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fppzcz

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-05 06:04:24
引用回帖:
Originally posted by ymzfeng at 2010-08-03 21:46:35:
最近比较郁闷，将构建一个基因的表达载体，用的载体是PBI121，转化大肠杆菌后，菌落PCR检测有阳性菌落，用空的PBI121做对照的没有检测到目的片段，但是提质粒后进行PCR和BamH1和Xba1双酶切检测都没有结果，反复做 ...

不确定在菌落PCR中有没有问题，之前也出现过，在做菌落PCR的时候没有问题，之后提质粒双酶切之后又问题了，找原因原来是由于在做菌落PCR时候，另一方面保种，这个要同时做，不能贪图省时，一边PCR一边药瓶接种提质粒，这样很容易跳出来的菌落不纯，导致后续试验的失败。。。应该按照做菌落PCR时候，另一方面保种，等到平板长出来，再依据PCR结果进行选择性的进行，建议做菌落PCR一次做9个，另外加一个阳性对照还有一个空白。
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16楼2010-08-04 17:43:31
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ymzfeng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by fppzcz at 2010-08-04 17:43:31:


不确定在菌落PCR中有没有问题，之前也出现过，在做菌落PCR的时候没有问题，之后提质粒双酶切之后又问题了，找原因原来是由于在做菌落PCR时候，另一方面保种，这个要同时做，不能贪图省时，一边PCR一边药瓶接种 ...

谢谢提醒
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17楼2010-08-04 19:08:57
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louli

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by ymzfeng at 2010-08-04 10:43:01:

质粒跑出的是两条带，跑得慢那条明亮，另一条较暗些

两条带也可以，正常时3条，但是应该最下面那条亮吧
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18楼2010-08-04 22:19:01
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cpu2004

金虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-08-05 06:04:32
酶切最准确，但是也很容易出错，建议按照质粒说明书合成一对测序引物，然后每次筛选用这对引物做PCR，看P出来的条带大小是不是插入片段大小+部分质粒序列的大小
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19楼2010-08-04 23:27:43
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ymzfeng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by cpu2004 at 2010-08-04 23:27:43:
酶切最准确，但是也很容易出错，建议按照质粒说明书合成一对测序引物，然后每次筛选用这对引物做PCR，看P出来的条带大小是不是插入片段大小+部分质粒序列的大小

这倒是个办法，谢谢了
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20楼2010-08-05 08:32:58
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