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huang1030

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于毕赤酵母电转后PCR验证问题已有16人参与

我们实验室做毕赤酵母电转一直没转成,以前转完不是不长,就是长满了整块板,而且后来还长出红的。最近从别人那弄了一支菌,我们实验室用的是GS115,转完后看情形挺正常的,长得不是很多,形态也正确,挑了几个摇菌后PCR,确什么也没P到,是怎么回事呢?还是没转进去吗?我是跟师兄做的,我也不是很懂,望各位大侠多多指教,谢谢!
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3):good! 2010-08-05 12:48:00
用的是什么筛选,如果是营养缺陷型筛选,一般长出来的都是阳性的。抗生素筛选的话就不大好说。
另外摇菌后PCR,如果是菌液PCR或菌落PCR,酵母肯定做不了,还是提下基因组吧。
也有人说菌液冷冻后煮沸做菌液pcr,我试过,没成功。
Thank-you,so-blue.
2楼2010-08-05 09:55:38
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huang1030

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-08-05 09:55:38:
用的是什么筛选,如果是营养缺陷型筛选,一般长出来的都是阳性的。抗生素筛选的话就不大好说。
另外摇菌后PCR,如果是菌液PCR或菌落PCR,酵母肯定做不了,还是提下基因组吧。
也有人说菌液冷冻后煮沸做菌液pcr, ...

是用营养缺陷筛选的。PCR是直接菌落煮冻煮后做的。以前转化后用同样方法P出来的还有一条条带呢,只是根据毕赤酵母操作手册上说转化后应该是有两条条带的,这次怎么一条条带也没有了呢。。。
3楼2010-08-05 10:37:19
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


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还是提一下基因组再pcr吧。
你转化时可以做一个对照,不加质粒的转化,涂板看看菌体是不是有问题。
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-08-05 13:37:15
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huang1030

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-08-05 13:37:15:
还是提一下基因组再pcr吧。
你转化时可以做一个对照,不加质粒的转化,涂板看看菌体是不是有问题。

好的,谢谢你哦!
5楼2010-08-05 13:55:13
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金虫鸣晓

铜虫 (小有名气)


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你的片段是多长?
如果太大,即使转到酵母里,也是P不出来的。
建议PCR的片段不要超过1000bp。
另外,建议用新鲜的菌液做PCR,收集菌体后煮沸10分钟
6楼2010-08-05 14:02:39
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)


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直接筛表达
7楼2010-08-05 14:08:53
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huang1030

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 金虫鸣晓 at 2010-08-05 14:02:39:
你的片段是多长?
如果太大,即使转到酵母里,也是P不出来的。
建议PCR的片段不要超过1000bp。
另外,建议用新鲜的菌液做PCR,收集菌体后煮沸10分钟

片段2000多bp,菌液是用的新鲜的,是煮沸半个小时,冻十分钟,再煮沸半个小时,然后用无菌水洗了以后再做PCR的。
8楼2010-08-05 15:23:50
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金虫鸣晓

铜虫 (小有名气)


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2000bp太长,你从中间设计一个引物,PCR的片段短点
9楼2010-08-07 11:05:56
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zzp55zzp

新虫 (初入文坛)


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2000bp有点长了,在中间找段特异片段扩下看看
10楼2010-08-09 11:01:57
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