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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于毕赤酵母电转后PCR验证问题
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huang1030

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于毕赤酵母电转后PCR验证问题 已有16人参与

我们实验室做毕赤酵母电转一直没转成，以前转完不是不长，就是长满了整块板，而且后来还长出红的。最近从别人那弄了一支菌，我们实验室用的是GS115，转完后看情形挺正常的，长得不是很多，形态也正确，挑了几个摇菌后PCR，确什么也没P到，是怎么回事呢？还是没转进去吗？我是跟师兄做的，我也不是很懂，望各位大侠多多指教，谢谢！
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1楼 2010-08-05 08:47:09
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3):good！ 2010-08-05 12:48:00
用的是什么筛选，如果是营养缺陷型筛选，一般长出来的都是阳性的。抗生素筛选的话就不大好说。
另外摇菌后PCR，如果是菌液PCR或菌落PCR，酵母肯定做不了，还是提下基因组吧。
也有人说菌液冷冻后煮沸做菌液pcr，我试过，没成功。
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Thank-you，so-blue.
2楼2010-08-05 09:55:38
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普通回帖

huang1030

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-08-05 09:55:38:
用的是什么筛选，如果是营养缺陷型筛选，一般长出来的都是阳性的。抗生素筛选的话就不大好说。
另外摇菌后PCR，如果是菌液PCR或菌落PCR，酵母肯定做不了，还是提下基因组吧。
也有人说菌液冷冻后煮沸做菌液pcr， ...

是用营养缺陷筛选的。PCR是直接菌落煮冻煮后做的。以前转化后用同样方法P出来的还有一条条带呢，只是根据毕赤酵母操作手册上说转化后应该是有两条条带的，这次怎么一条条带也没有了呢。。。
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3楼2010-08-05 10:37:19
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
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还是提一下基因组再pcr吧。
你转化时可以做一个对照，不加质粒的转化，涂板看看菌体是不是有问题。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-08-05 13:37:15
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huang1030

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-08-05 13:37:15:
还是提一下基因组再pcr吧。
你转化时可以做一个对照，不加质粒的转化，涂板看看菌体是不是有问题。

好的，谢谢你哦！
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5楼2010-08-05 13:55:13
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金虫鸣晓

铜虫 (小有名气)
★
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你的片段是多长？
如果太大，即使转到酵母里，也是P不出来的。
建议PCR的片段不要超过1000bp。
另外，建议用新鲜的菌液做PCR，收集菌体后煮沸10分钟
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6楼2010-08-05 14:02:39
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
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直接筛表达
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7楼2010-08-05 14:08:53
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huang1030

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 金虫鸣晓 at 2010-08-05 14:02:39:
你的片段是多长？
如果太大，即使转到酵母里，也是P不出来的。
建议PCR的片段不要超过1000bp。
另外，建议用新鲜的菌液做PCR，收集菌体后煮沸10分钟

片段2000多bp，菌液是用的新鲜的，是煮沸半个小时，冻十分钟，再煮沸半个小时，然后用无菌水洗了以后再做PCR的。
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8楼2010-08-05 15:23:50
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金虫鸣晓

铜虫 (小有名气)
★
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2000bp太长，你从中间设计一个引物，PCR的片段短点
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9楼2010-08-07 11:05:56
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zzp55zzp

新虫 (初入文坛)
★
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2000bp有点长了，在中间找段特异片段扩下看看
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10楼2010-08-09 11:01:57
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