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bayleaf1987

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】有关菌液PCR的问题 已有13人参与

求助一下版里的各位大虾,这个菌液PCR的结果可靠性有多高?一般菌液PCR大家都是用什么做对照的?我用清水做模板总是会出现和目的条带相同大小的条带,换了新的引物,水,buffer,和酶以后结果还是一样,问了几个同学发现都有相同的问题,希望大家可以帮忙解答一下,如果菌液PCR的结果不可靠的话,我应该如何验证我的表达载体是否转入农杆菌呢?多谢。。
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-20 21:36:46
清水都出条带,那肯定是试剂或者耗材或者混样的过程中污染了。全套都换,同时用高压灭菌的耗材,戴手套在干净的环境下混样吧
另外,那个条带不是dimer吧
2楼2010-05-20 21:04:52
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bayleaf1987

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-05-20 21:04:52:
清水都出条带,那肯定是试剂或者耗材或者混样的过程中污染了。全套都换,同时用高压灭菌的耗材,戴手套在干净的环境下混样吧
另外,那个条带不是dimer吧

不是,和目的条带一样的,我把所有的都换了一遍,而且枪头什么都灭了40分钟,操作还特别注意了,结果还是出。。。。哭死了
3楼2010-05-21 09:46:42
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霖希


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操作台操作吧,我们一般是用质粒当模板,没考察过阴性的。
4楼2010-05-21 13:34:52
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feilr

木虫 (正式写手)


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肯定被什么污染了,不然怎么可能出条带呢,你用灭菌超纯水,新换试剂试试呢
5楼2010-05-21 13:56:58
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miya173

银虫 (小有名气)


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实验过程中什么被污染了吧,如果不是dimer那就只能是这个原因了,我们一般都用菌液做pcr,农杆菌的比较难扩。
6楼2010-05-21 14:14:52
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zgb1982

木虫 (正式写手)


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我也遇到这样的问题,而且扩2kb的时候就出现2kb条带,扩1.5 kb时清水对照就出现1.5kb条带,很迷茫.
7楼2010-05-21 15:55:35
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骚人追月

金虫 (小有名气)

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lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-22 13:11:02
清水出带的话,肯定是污染了,各种污染,自己摸索下。
最后鉴定一般都是先跑菌液PCR,再测序什么的。不行的话看一看酶切位点,可以通过酶切检测的方法。但是那样的话目的性不强,而且需要的内切酶量较大
会做饭就会做实验?
8楼2010-05-21 16:49:32
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


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不会是引物的问题吧,使用的是通用引物,还是目的片段本身的引物,如果是目的片段自身的引物,很大可能是引物的问题,如果是通用引物怀疑操作是最大的问题
9楼2010-05-21 17:21:25
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)

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lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-22 13:12:05
菌落PCR不能说明实质问题,最好提质粒酶切鉴定一下
10楼2010-05-21 21:22:59
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