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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】菌液PCR问题
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zzzccc

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】菌液PCR问题 已有4人参与

各位大仙给个意见，我最近想筛CDNA文库，挑了180个斑，前100多个摇了菌后PCR的结果都不错，可后几十个怎么都扩不出来。
   补充的是，我都是200转摇了6-7个小时，而且我摇出来的菌大多时间放在4°，共4、5天，并且我在准备PCR的时候菌在室温下放的时间也比较长，每次扩都放2、3个小时。这些是不是有影响，而且我有检测了一下我最初扩出的菌现在又扩增不出来了。郁闷，我刚刚接触分子方面的实验，请帮我找找原因，不胜感激！！
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1楼 2010-12-03 23:24:55
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wangleisdnu

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+3):good 2010-12-04 08:22:16
normally I follow this protocol
E. coli Colony PCR
1. Pick colony with toothpick and swirl into 25 μl of TE (or dH2O) in microfuge tube.
2. Heat in boiling water bath for 2 minutes (can be used directly for PCR).
3. Spin for 2 minutes at top speed in microfuge.
4. Transfer 20 μl of supernatant to new microfuge tube.
5. Use 1-2 μl as template in 25 μl PCR reaction.

in my hands it works well


maybe your culture concentration is too high, which affects the PCR reaction
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有勇气去改变你可以改变的,有度量去容忍你不能改变的,有智慧去区分上面的两种情况http://bbs.bioon.net/bbs/?66210
2楼2010-12-04 00:34:11
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
沙发同学方法很好啊，我要试试
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一直向前！
3楼2010-12-04 09:40:58
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
菌液pcr需要运气
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4楼2010-12-04 10:48:10
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zzzccc

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by wangleisdnu at 2010-12-04 00:34:11:
normally I follow this protocol
E. coli Colony PCR
1. Pick colony with toothpick and swirl into 25 μl of TE (or dH2O) in microfuge tube.
2. Heat in boiling water bath for 2 minutes (can be use ...

可能不是，我开始扩的结果都很好。郁闷！！，现在即便用原来的模板也扩不出来了，只能看到引物二聚体
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5楼2010-12-04 16:26:28
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