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【求助/交流】菌液PCR问题 已有4人参与
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各位大仙给个意见，我最近想筛CDNA文库，挑了180个斑，前100多个摇了菌后PCR的结果都不错，可后几十个怎么都扩不出来。 补充的是，我都是200转摇了6-7个小时，而且我摇出来的菌大多时间放在4°，共4、5天，并且我在准备PCR的时候菌在室温下放的时间也比较长，每次扩都放2、3个小时。这些是不是有影响，而且我有检测了一下我最初扩出的菌现在又扩增不出来了。郁闷，我刚刚接触分子方面的实验，请帮我找找原因，不胜感激！！ |
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zhangxn2010
木虫 (著名写手)
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3楼2010-12-04 09:40:58
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+3):good 2010-12-04 08:22:16
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+3):good 2010-12-04 08:22:16
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normally I follow this protocol E. coli Colony PCR 1. Pick colony with toothpick and swirl into 25 μl of TE (or dH2O) in microfuge tube. 2. Heat in boiling water bath for 2 minutes (can be used directly for PCR). 3. Spin for 2 minutes at top speed in microfuge. 4. Transfer 20 μl of supernatant to new microfuge tube. 5. Use 1-2 μl as template in 25 μl PCR reaction. in my hands it works well maybe your culture concentration is too high, which affects the PCR reaction |
2楼2010-12-04 00:34:11
5楼2010-12-04 16:26:28
