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shaquila金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】3'RACE 结果有问题～～～ 已有3人参与
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用clontech的试剂盒做的3'race反转，一共做了两个基因～～ 做了一次nest pcr 得到比较单一的条带（600bp左右，kodplus 回收加A），回收连18t测序摇菌测序～～ 其中一个基因A，三个克隆的序列都是一致的，和NCBI的DNA序列也是一样～～ 另一个基因B就有点古怪了，菌液PCR结果有部分条带比回收带小的，当时取了5个测序（3个正常带，2个较小的条带），2个较小的带靠近GSP区200bp是目的序列，后面是来自另一条染色体的序列，3个正常的带结果还算正常，只是它们长度不同 如图所示  而且有两个疑问 1.多出来的序列在基因组中能够匹配，但是polyA之前的第一个序列与基因组不匹配，如C应该为T，排除测序问题，送了两个公司测，不同的克隆 2.根据clontech的引物说明，反转用的引物序列如下所示，polyA有30个，两个基因都没有这么多，A有24个，B的两个测序产物只有14和13，不知道为什么会这样，求解～～ 3'-RACE CDS Primer A (3'-CDS; 12 µM) 5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 V N–3' (N = A, C, G, or T; V = A, G, or C) 附3’引物混合物序列： 10X Universal Primer A Mix (UPM) Long (0.4 µM): 5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3' Short (2 µM): 5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3 [ Last edited by shaquila on 2010-12-15 at 16:00 ] |
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shaquila
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shaquila
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silicare(金币+1):鼓励上图 2010-12-27 11:51:23
silicare(金币+1):鼓励上图 2010-12-27 11:51:23
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嗯，谢谢楼上，觉得很奇怪，是不是没有拿到3‘全长，3个正常带中有两个比较短20个bp，另外这个基因的polyA前面的第一个碱基在基因组中总是不匹配～～ 另外问个5’问题，用的也是clontech的试剂盒，RNA接头连上后反转， 试了takara的几个pcr聚合酶，都没有条带，然后换toyobo的kod酶（做3‘时候发现用takara酶的LA也没有条带，后来用kod才出来），两个基因设计8对引物，其中有条带，但是有杂带～～ 二次出来有两条引物条带很亮，但是测序结果都不对，在引物中间的序列乱七八糟，在blast比对后，发现在基因组中有多拷贝，估计是什么组蛋白之类高丰度的mRNA。 把产物稀释后做nested pcr，基本没有条带，是不是排除了酶和引物的问题,是5’race没有做好～～ 最近一次的结果如图所示： 1-4引物是基因A，5-7引物基因B 4的nested引物是引物2 5的nested引物是引物6  [ Last edited by shaquila on 2010-12-23 at 18:16 ] |
7楼2010-12-23 18:14:38
rainwander
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8楼2010-12-23 18:53:52
shaquila
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