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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】3'RACE 结果有问题～～～
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shaquila

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】3'RACE 结果有问题～～～已有3人参与

用clontech的试剂盒做的3'race反转，一共做了两个基因～～
做了一次nest pcr 得到比较单一的条带（600bp左右，kodplus 回收加A），回收连18t测序摇菌测序～～
其中一个基因A，三个克隆的序列都是一致的，和NCBI的DNA序列也是一样～～
另一个基因B就有点古怪了，菌液PCR结果有部分条带比回收带小的，当时取了5个测序（3个正常带，2个较小的条带），2个较小的带靠近GSP区200bp是目的序列，后面是来自另一条染色体的序列，3个正常的带结果还算正常，只是它们长度不同
如图所示

而且有两个疑问
1.多出来的序列在基因组中能够匹配，但是polyA之前的第一个序列与基因组不匹配，如C应该为T，排除测序问题，送了两个公司测，不同的克隆
2.根据clontech的引物说明，反转用的引物序列如下所示，polyA有30个，两个基因都没有这么多，A有24个，B的两个测序产物只有14和13，不知道为什么会这样，求解～～
3'-RACE CDS Primer A (3'-CDS; 12 µM)
     5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 V N–3'
     (N = A, C, G, or T; V = A, G, or C)


附3’引物混合物序列：
10X Universal Primer A Mix (UPM)
     Long (0.4 µM):  
     5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'
     Short (2 µM): 5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3

[ Last edited by shaquila on 2010-12-15 at 16:00 ]
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1楼2010-12-15 15:56:12
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shaquila

金虫 (正式写手)
大家帮帮忙啊，555
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2楼2010-12-16 12:51:36
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shaquila

金虫 (正式写手)
再顶顶～～
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3楼2010-12-17 08:54:54
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shaquila

金虫 (正式写手)
额，没人理我
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4楼2010-12-23 15:30:13
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2010-12-15 15:56:12:
用clontech的试剂盒做的3'race反转，一共做了两个基因～～
做了一次nest pcr 得到比较单一的条带（600bp左右，kodplus 回收加A），回收连18t测序摇菌测序～～
其中一个基因A，三个克隆的序列都是一致的，和NCBI ...

基因B不是有三个正常的么，直接用就行了。那两个比较小的可以暂时不考虑。
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5楼2010-12-23 15:47:21
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
另，我记得invitrogen有个race试剂盒，3’5’可以一起出来，比较好用
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6楼2010-12-23 15:49:13
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shaquila

金虫 (正式写手)
★
silicare(金币+1):鼓励上图 2010-12-27 11:51:23
嗯，谢谢楼上，觉得很奇怪，是不是没有拿到3‘全长，3个正常带中有两个比较短20个bp，另外这个基因的polyA前面的第一个碱基在基因组中总是不匹配～～
另外问个5’问题，用的也是clontech的试剂盒，RNA接头连上后反转，
试了takara的几个pcr聚合酶，都没有条带，然后换toyobo的kod酶（做3‘时候发现用takara酶的LA也没有条带，后来用kod才出来），两个基因设计8对引物，其中有条带，但是有杂带～～
二次出来有两条引物条带很亮，但是测序结果都不对，在引物中间的序列乱七八糟，在blast比对后，发现在基因组中有多拷贝，估计是什么组蛋白之类高丰度的mRNA。
把产物稀释后做nested pcr，基本没有条带，是不是排除了酶和引物的问题,是5’race没有做好～～
最近一次的结果如图所示：
1-4引物是基因A，5-7引物基因B
4的nested引物是引物2
5的nested引物是引物6


[ Last edited by shaquila on 2010-12-23 at 18:16 ]
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7楼2010-12-23 18:14:38
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)

优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不懂这方面，帮你顶一下
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千万不要因为走的太久，而忘记了我们为什么出发~~~~~~ForDream~~~~~~
8楼2010-12-23 18:53:52
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shaquila

金虫 (正式写手)
顶一下～～～～～
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9楼2010-12-27 08:52:56
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