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songxiaobop金虫 (小有名气)
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[求助]
3'RACE做了几次，为什么老是这样子，大家看一下帮帮忙吧，苦闷死了！~
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用的是TAKARA的盒子 这个是做巢式PCR的第一轮扩增，似乎是又一条带，然后就按照说明书的要求，取1微升做了第二轮扩增，结果是这个样子。 然后几次做的都是下边这样的：  反转录体系中要求RNA的量是1微克，可是我感觉自己提的RNA浓度比较低，反转录体系是10微升的，怎样保证反转录的效果，怎样检测？ 巢式扩增是不是按照说明书上的50微升体系比较好？ 这样的结果应该怎样调整一下体系？ 快毕业了，很是着急苦闷啊 。 求大家帮帮忙！    [ 来自科研家族 深海家族 ] |
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【答案】应助回帖
★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！whs 2011-12-07 11:43:58
songxiaobop(金币+2): 2011-12-19 08:42:46
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！whs 2011-12-07 11:43:58
songxiaobop(金币+2): 2011-12-19 08:42:46
| 最好是每做一步都做检测，提取RNA后检测RNA的完整性，如果质量不好，RACE很难出结果。一般来说3RACE相对容易做，建议多设计几条RACE引物，一般来说扩增出来的条带全部回收后测序（一条带很可能不是我们感兴趣的），当然大部分是无用的序列，可能只有十分之一二才是目的序列。做RACE是个很熬人的活，我最近做了7个基因的RACE,设计了50多条RACE引物，做了三四轮RACE,回收片段多达120多个，全部做了TA克隆，测序不下200个样，到目前为止6个基因是扩增到全长了，其中一个还是没有拿到目的片段，打算放弃了。做RACE是个体力活，依个人经验来看，回收一两个片段就能得到感兴趣的基因是不可能的。 |
4楼2011-12-06 23:43:19
shaquila
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5楼2011-12-07 10:00:36
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