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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3'RACE做了几次，为什么老是这样子，大家看一下帮帮忙吧，苦闷死了！~
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songxiaobop

金虫 (小有名气)

[求助] 3'RACE做了几次，为什么老是这样子，大家看一下帮帮忙吧，苦闷死了！~

用的是TAKARA的盒子
这个是做巢式PCR的第一轮扩增，似乎是又一条带，然后就按照说明书的要求，取1微升做了第二轮扩增，结果是这个样子。

然后几次做的都是下边这样的：

反转录体系中要求RNA的量是1微克，可是我感觉自己提的RNA浓度比较低，反转录体系是10微升的，怎样保证反转录的效果，怎样检测？
巢式扩增是不是按照说明书上的50微升体系比较好？
这样的结果应该怎样调整一下体系？
快毕业了，很是着急苦闷啊 。
求大家帮帮忙！










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1楼 2011-12-06 09:13:05
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wjm0403

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！whs 2011-12-07 11:43:58
songxiaobop(金币+2): 2011-12-19 08:42:46
最好是每做一步都做检测，提取RNA后检测RNA的完整性，如果质量不好，RACE很难出结果。一般来说3RACE相对容易做，建议多设计几条RACE引物，一般来说扩增出来的条带全部回收后测序（一条带很可能不是我们感兴趣的），当然大部分是无用的序列，可能只有十分之一二才是目的序列。做RACE是个很熬人的活，我最近做了7个基因的RACE,设计了50多条RACE引物，做了三四轮RACE,回收片段多达120多个，全部做了TA克隆，测序不下200个样，到目前为止6个基因是扩增到全长了，其中一个还是没有拿到目的片段，打算放弃了。做RACE是个体力活，依个人经验来看，回收一两个片段就能得到感兴趣的基因是不可能的。
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4楼2011-12-06 23:43:19
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-12-08 18:47:02
songxiaobop(金币+3): 2011-12-19 08:42:52
做race,特别是5端,用nested引物最保险,不然拿到的很多非特异性扩增条带~~
3'就容易多了,一般的PCR酶,takara的LA可以试试,虽然保真性不好,但扩增效率还不错
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5楼2011-12-07 10:00:36
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普通回帖

zcy1214

木虫 (著名写手)

普通青年

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-12-06 20:05:47
songxiaobop(金币+2): 2011-12-19 08:42:38
压根就没带，是不是你反转录有问题的嗯，
我也是新手，我虽然有条带，但不是我要的，呜呜
一起努力哈
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达则兼济天下，穷则独善其身
2楼2011-12-06 18:27:48
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songxiaobop

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zcy1214 at 2011-12-06 18:27:48:
压根就没带，是不是你反转录有问题的嗯，
我也是新手，我虽然有条带，但不是我要的，呜呜
一起努力哈

我也怀疑是我的反转录有问题，RNA提的到是还行，就是浓度有点低。
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3楼2011-12-06 22:10:46
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wjm0403 at 2011-12-06 23:43:19:
最好是每做一步都做检测，提取RNA后检测RNA的完整性，如果质量不好，RACE很难出结果。一般来说3RACE相对容易做，建议多设计几条RACE引物，一般来说扩增出来的条带全部回收后测序（一条带很可能不是我们感兴趣的） ...

想问一下全长引物的设计是怎样设计的啊？
有什么需要注意的吗？
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6楼2011-12-07 10:19:34
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
1楼: Originally posted by songxiaobop at 2011-12-06 09:13:05:
用的是TAKARA的盒子
这个是做巢式PCR的第一轮扩增，似乎是又一条带，然后就按照说明书的要求，取1微升做了第二轮扩增，结果是这个样 ...

第二轮PCR提高退火温度1-2度，循环数也加大一点试试
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7楼2011-12-07 10:20:55
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songxiaobop

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-07 10:00:36:
做race,特别是5端,用nested引物最保险,不然拿到的很多非特异性扩增条带~~
3'就容易多了,一般的PCR酶,takara的LA可以试试,虽然保真性不好,但扩增效率还不错

请教一下：试剂盒里给的反转录体系是10微升的，可是我的RNA浓度比较低，还要求TotalRNA的量是1微克。体系是：RNAX微升；3‘RACEAdaptor 1ul；5xM-MLV Buffer 2ul;dNTP 1ul;Rnase Inhibitor 0.25 ul；酶0.25ul；Rnase Free water5.5-Xul。 这个怎么办呢,高手？
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8楼2011-12-07 10:58:41
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zcy1214

木虫 (著名写手)

普通青年

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): Good！可以跑actin等内参基因。 2011-12-08 18:47:40
引用回帖:
3楼: Originally posted by songxiaobop at 2011-12-06 22:10:46:
我也怀疑是我的反转录有问题，RNA提的到是还行，就是浓度有点低。

那就把反转录的跑个PCR检测下哈
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达则兼济天下，穷则独善其身
9楼2011-12-07 22:28:46
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忘忧草_

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

songxiaobop(金币+3): 2011-12-19 08:43:10
个人感觉，在模板没问题的前提下，退火温度比较关键，比一般的pcr要稍高，第二次pcr适当增加循环数。
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不将就
10楼2011-12-08 22:22:46
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