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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3‘race的怪异现象
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ptccc

铜虫 (初入文坛)

[求助] 3‘race的怪异现象

最近做了一个月的3’race，跌跌撞撞，一直栽在同一个问题上。第一次用GSP扩增出大概有200bp的条带，连接T载体后转化测序，只得到大概130bp的片段，后面有22个A，A后面接着3‘接头；A前面的碱基序列都是对的，也就是CAAGGGCTGCCTTAGCTGTCAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，无终止密码，而且CDS也应该还差十几个碱基。我重新设了引物再一次做，怪异的现象出来了，出来的后面序列也是一模一样，就是一到CAAGGGCTGCCTTAGCTGTCAAGAA就直接出现POLY a了。GAA后面的几个氨基酸死活出不来，那POLY A是怎么出来的呀！！！！！两次都有做过巢式，测序到GAA也是没有后面的几个碱基。这是为什么呀~~~求助~~~研一的孩子对实验都没热情了。。。。
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1楼 2013-11-29 14:47:48
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rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-29 17:15:08
ptccc: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-11-29 20:30:46
应该是合成3‘RACE模板的时候，POLY-T提前加到尾巴前面了，即错配了。可以换新RNA重新合成，还不行只能换一家公司的3’接头重新RT合成模板。
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2楼2013-11-29 16:21:50
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ptccc: 金币+2, ★有帮助 2013-11-29 20:30:56
GAA后的序列应该是什么？
用的哪家的试剂盒？
也可能是剪切位点就是这样
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借你一生好不好
3楼2013-11-29 19:35:09
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ptccc

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by rodickholm at 2013-11-29 16:21:50
应该是合成3‘RACE模板的时候，POLY-T提前加到尾巴前面了，即错配了。可以换新RNA重新合成，还不行只能换一家公司的3’接头重新RT合成模板。

谢谢您的答复。
我曾经怀疑过这个，但是这个模板是师兄师姐之前弄好的，他们也用过，应该没什么问题吧。不过这也是一个参考。我明天换一个模板试试看。谢谢~
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4楼2013-11-29 20:27:05
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ptccc

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 不叶珏 at 2013-11-29 19:35:09
GAA后的序列应该是什么？
用的哪家的试剂盒？
也可能是剪切位点就是这样

近缘物种中GAA后的还有九个编码Lys的氨基酸，近源物种中是GAAGAAGAA，但是后来我怀疑过会不会是AAA编码的Lys，但是这一连串A后面直接是接头引物，我就很疑惑了。
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5楼2013-11-29 20:29:57
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夜舞龙

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人意见：CAAGAAGAAGAA 这样重复的序列可能带来测序错误，从另一个方向测序试试，看看你说的后边那几个碱基从另一个方向测存在不。
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6楼2013-11-29 21:13:34
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杨惠源

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by ptccc at 2013-11-29 14:47:48
最近做了一个月的3’race，跌跌撞撞，一直栽在同一个问题上。第一次用GSP扩增出大概有200bp的条带，连接T载体后转化测序，只得到大概130bp的片段，后面有22个A，A后面接着3‘接头；A前面的碱基序列都是对的，也就是 ...

题主，看到你多年前的帖子，，，我现在也出现了相同的问题，不知道当时你是怎么解决的阿，求赐教阿，不胜感激。自己快愁哭了

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7楼2018-01-17 02:13:28
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