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[求助]
3‘race 求助，急
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最近一直做一基因家族成员的3’race，有3条，一条做出了全长，一条得到了中间片段和3’，还有一条只有中间片段。前面那些是师姐做的，我要做出来全长，可是最后这个的3’一直做不出来。用的是takara 3‘full race试剂盒。以前跑巢式都只有引物二聚体，现在是图片中显示的情况。请问是不是非特异扩增？怎样减少？用的温度梯度。 [ Last edited by yiyi12 on 2012-5-7 at 21:03 ] |
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4楼2012-05-08 10:32:09
【答案】应助回帖
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yiyi12: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-10 22:25:48
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你做内向PCR了没，外向有时都会出现这种情况，再做一下内向就行了。 3-RACE相对来说要好做的多，以前我也用宝生物的试剂盒，没出过问题。但现在都是直接合成引物，反转录后直接扩增，现在告诉楼主一种新方法： QT：CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTT TTTTTTT Q0：CCAGTGAGCAGAGTGACG Q1：GAGGACTCGAGCTCAAGC 因为RNA的3末端加有polyA尾巴，，用上面加一通用引物的QT引物做反转录，也即取代之前的Oligo dT，得到的cDNA除了有poly(T)外，还有两个通用引物，然后用Q0作外向PCR，Q1做内向PCR，上游引物用你的基因特异性引物就行了。 |
3楼2012-05-08 09:03:42
hellolin
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zhengli123
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xiazhiwuxie
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10楼2012-05-09 08:51:34
5