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lianyi1989

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】3'RACE求助

最近在做两条基因的RACE,一条已经搞定,另外一条5'也已经出来了,但是3'却一直卡着,卡了一个月了~这个3'已经出条带了,但是测序总不对,有polyA和UPM,但是找不到上游引物,和原来的序列也拼接不上,重做了两次,测序结果都是这样...然后就重新设计引物,已经5条了,但是就是弥散,连条带都没有了~ cDNA应该是没问题的,因为另外一条基因都出结果了,用的clontech的smarter的盒子,程序和体系都是按说明说上推荐来的,也应该不会有什么问题,现在真不知道是哪有问题,请各位虫友们给给意见,急死了~另外,我这3'真是做不出来的话,有没有别方法可以得到全长?我的基因全长是1600bp左右,现在已经得到了1200多了,就差3'那边的300—400bp的了。谢谢大家啦~
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)

★
lianyi1989(金币+1):谢谢参与
用inner扩下,或者用polyT试试,不行tail也做做
2楼2010-10-04 21:45:43
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★
lianyi1989(金币+1):谢谢参与
3楼2010-10-04 21:52:57
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lianyi1989

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by lhwei1987 at 2010-10-04 21:45:43:
用inner扩下,或者用polyT试试,不行tail也做做

谢谢,不过能不能详细说明下,不是很懂~ps:我是新手...无限感激了
4楼2010-10-05 10:29:57
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大白菜123789

铜虫 (小有名气)

★
lianyi1989(金币+1):谢谢参与
换引物,找保守区的引物试试!
5楼2010-10-05 15:39:22
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booew

新虫 (初入文坛)

★
lianyi1989(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by lianyi1989 at 2010-10-04 20:36:02:
最近在做两条基因的RACE,一条已经搞定,另外一条5'也已经出来了,但是3'却一直卡着,卡了一个月了~这个3'已经出条带了,但是测序总不对,有polyA和UPM,但是找不到上游引物,和原来的序列也拼接不上,重做了两次 ...

用两条特异引物做巢式
6楼2010-10-05 16:09:02
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suguolian

新虫 (初入文坛)

★
lianyi1989(金币+1): 谢谢参与
我做的是3’-RACE,用的invitrogen的M-MLV RT反转录试剂盒做,引物是特异性引物与oligo dT加尾,这样能做出来吗?求各位虫友帮忙……不胜感激
7楼2013-09-11 10:25:02
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雙子の殇

金虫 (正式写手)

★
lianyi1989(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
7楼: Originally posted by suguolian at 2013-09-11 10:25:02
我做的是3’-RACE,用的invitrogen的M-MLV RT反转录试剂盒做,引物是特异性引物与oligo dT加尾,这样能做出来吗?求各位虫友帮忙……不胜感激

多长的片段?我之前做出来三千多的,用半套式做的

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2013-09-12 00:19:52
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suguolian

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 雙子の殇 at 2013-09-12 00:19:52
多长的片段?我之前做出来三千多的,用半套式做的
...

200-300左右吧!后面换了Takara的3‘RACE试剂盒也没结果,请楼主多多指导!!!
9楼2013-09-29 08:51:06
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雙子の殇

金虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by suguolian at 2013-09-29 08:51:06
200-300左右吧!后面换了Takara的3‘RACE试剂盒也没结果,请楼主多多指导!!!...

那么短应该很容易啊,你确定它有polyA吗?如果有,设计一个好的上游引物一下就出来了,或者设计两个上游引物做一下半套式

[ 发自小木虫客户端 ]

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

10楼2013-09-29 09:35:07
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