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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】3'RACE求助
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lianyi1989

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】3'RACE求助

最近在做两条基因的RACE，一条已经搞定，另外一条5'也已经出来了，但是3'却一直卡着，卡了一个月了~这个3'已经出条带了，但是测序总不对，有polyA和UPM，但是找不到上游引物，和原来的序列也拼接不上，重做了两次，测序结果都是这样...然后就重新设计引物，已经5条了，但是就是弥散，连条带都没有了~ cDNA应该是没问题的，因为另外一条基因都出结果了，用的clontech的smarter的盒子，程序和体系都是按说明说上推荐来的，也应该不会有什么问题，现在真不知道是哪有问题，请各位虫友们给给意见，急死了~另外，我这3'真是做不出来的话，有没有别方法可以得到全长？我的基因全长是1600bp左右，现在已经得到了1200多了，就差3'那边的300—400bp的了。谢谢大家啦~
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1楼 2010-10-04 20:36:02
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
★
lianyi1989(金币+1):谢谢参与
用inner扩下，或者用polyT试试，不行tail也做做
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2楼2010-10-04 21:45:43
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bbcai321
★
lianyi1989(金币+1):谢谢参与
3楼2010-10-04 21:52:57
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lianyi1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lhwei1987 at 2010-10-04 21:45:43:
用inner扩下，或者用polyT试试，不行tail也做做

谢谢，不过能不能详细说明下，不是很懂~ps：我是新手...无限感激了
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4楼2010-10-05 10:29:57
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大白菜123789

铜虫 (小有名气)
★
lianyi1989(金币+1):谢谢参与
换引物，找保守区的引物试试！
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5楼2010-10-05 15:39:22
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booew

新虫 (初入文坛)
★
lianyi1989(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by lianyi1989 at 2010-10-04 20:36:02:
最近在做两条基因的RACE，一条已经搞定，另外一条5'也已经出来了，但是3'却一直卡着，卡了一个月了~这个3'已经出条带了，但是测序总不对，有polyA和UPM，但是找不到上游引物，和原来的序列也拼接不上，重做了两次 ...

用两条特异引物做巢式
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6楼2010-10-05 16:09:02
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suguolian

新虫 (初入文坛)
★
lianyi1989(金币+1): 谢谢参与
我做的是3’-RACE，用的invitrogen的M-MLV RT反转录试剂盒做，引物是特异性引物与oligo dT加尾，这样能做出来吗？求各位虫友帮忙……不胜感激
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7楼2013-09-11 10:25:02
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雙子の殇

金虫 (正式写手)
★
lianyi1989(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
7楼: Originally posted by suguolian at 2013-09-11 10:25:02
我做的是3’-RACE，用的invitrogen的M-MLV RT反转录试剂盒做，引物是特异性引物与oligo dT加尾，这样能做出来吗？求各位虫友帮忙……不胜感激

多长的片段？我之前做出来三千多的，用半套式做的

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8楼2013-09-12 00:19:52
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suguolian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 雙子の殇 at 2013-09-12 00:19:52
多长的片段？我之前做出来三千多的，用半套式做的
...

200-300左右吧！后面换了Takara的3‘RACE试剂盒也没结果，请楼主多多指导！！！
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9楼2013-09-29 08:51:06
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雙子の殇

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by suguolian at 2013-09-29 08:51:06
200-300左右吧！后面换了Takara的3‘RACE试剂盒也没结果，请楼主多多指导！！！...

那么短应该很容易啊，你确定它有polyA吗？如果有，设计一个好的上游引物一下就出来了，或者设计两个上游引物做一下半套式

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liubolin945
10楼2013-09-29 09:35:07
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