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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】5-RACE问题
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】5-RACE问题 已有7人参与

最近在做RACE，有些地方不太懂，请虫友赐教！！
1.做5-RACE时，要先将RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基团，然后再去掉帽子，保留一个磷酸基团，那第一步“将RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基团，”是不是为了“去掉帽子”的需要？RNA的结构是怎么样的？
2.接下来要加上接头引物，然后进行反转录反应，得到cDNA后，进行outer 和innner PCR，这里面的outer 和innner primer处在什么位置，它们离adaptor primer有多远啊，假如用outer primer扩出带后，那得到的这一段就是基因的5-末端吗，再往前就没有了吗？
谢谢！！！


还有一个问题，5-RACE得到基因的5-末端后，与3-端结合到一起形成一个完整的基因，它的结构除了ORF还有有哪些，5-端有没有启动子等结构，

[ Last edited by 小猫三两只 on 2010-7-1 at 12:15 ]
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1楼 2010-06-30 18:08:47
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won7

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+2):谢谢交流 2010-06-30 21:50:54
1，你所说的RACE是RLM-RACE法，第一步“将RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基团，”不是为了去帽子，是为了把不完整的mRNA和非mRNA的磷酸基团去掉，这样遮些RNA将无法与接头连接，从而提高5RACE的效率，保证得到的片段都是完整的。这与SMART-RACE不同。帽子结构有3个磷酸基团（不完整的mRNA和非mRNA的没有帽子结构），去帽子时只去掉两个基团，保留一个，这是连接接头必须的。
2， outer 和innner primer都是在接头的位置，只是innner primer在outer primer前面一些碱基。从原理得知，用这个方法得到的是完整的5-末端，前面没有了。

[ Last edited by won7 on 2010-6-30 at 21:53 ]
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2楼2010-06-30 21:49:44
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by won7 at 2010-06-30 21:49:44:
1，你所说的RACE是RLM-RACE法，第一步“将RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基团，”不是为了去帽子，是为了把不完整的mRNA和非mRNA的磷酸基团去掉，这样遮些RNA将无法与接头连接，从而提高5RACE的效率，保证得到的片段 ...

1 你说的RLM-RACE法中，去磷酸化“是为了把不完整的mRNA和非mRNA的磷酸基团去掉”，难道不会把完整的mRNA中的磷酸基因去掉吗？
2  你说outer 和inner primer 都在接头附近，那知不知道接头引物的序列，如果知道，那上游引物直接用接头引物，下游用GSP行不行
不知道理解的对不对啊，谢谢！！
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3楼2010-07-01 12:07:20
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won7

金虫 (小有名气)
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小猫三两只(金币+5):非常感谢,现在清楚了 2010-07-01 15:35:18
1,碱性磷酸酶能把裸露的磷酸基团去掉，而完整的mRNA 5末端有帽子结构保护，不能被去掉,用烟草酸焦磷酸酶可以去掉头两个磷酸，留下一个，便于与接头连接。
完整mRNA: m7G-p-p-p-----------------------------------AAAAAAAA
不完整mRNA: PO4---------------------------------------AAAAAAAAAA
2，outer 和inner primer 不是在接头附近，而是在接头上。接头也是一段RNA，接头的序列是知道的，outer 和inner prime的序列也知道，试剂盒说明书提供序列，可以查看。由于接头是RNA，所以不能直接作引物，下游肯定是GSP了。

3，启动子序列是不被转录的，完整的mRNA不会有启动子序列。

[ Last edited by won7 on 2010-7-1 at 12:48 ]
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4楼2010-07-01 12:45:48
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by won7 at 2010-07-01 12:45:48:
1,碱性磷酸酶能把裸露的磷酸基团去掉，而完整的mRNA 5末端有帽子结构保护，不能被去掉,用烟草酸焦磷酸酶可以去掉头两个磷酸，留下一个，便于与接头连接。
完整mRNA: m7G-p-p-p--------------------------------- ...

还想再问一下,把5-RACE和3-RACE都做完后,测序得到了这两段的序列,一下步要怎么做得到全长呢
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5楼2010-07-01 15:37:05
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 小猫三两只 at 2010-07-01 15:37:05:

还想再问一下,把5-RACE和3-RACE都做完后,测序得到了这两段的序列,一下步要怎么做得到全长呢

做完了就可以知道这个基因的编码区，直接设计引物，用你cDNA为模板，不就可以扩增出这个基因的全长吗！！
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6楼2010-07-01 15:46:51
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won7

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
xiangquanju  说的没错。其实你在设计GSP的时候，注意把3-RACE设计在靠5端，5-RACE设计在3端，这样得到的5-RACE和3-RACE片段有重叠区，据此拼接就得到全长了。
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7楼2010-07-01 20:47:00
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 小猫三两只 at 2010-07-01 15:37:05:

还想再问一下,把5-RACE和3-RACE都做完后,测序得到了这两段的序列,一下步要怎么做得到全长呢

5‘ 的片段，用于设计引物的已知片段，3’片段，这三者肯定是能重叠的吧，三个拼起来，去掉重叠区就是全长了

更简单的情况下，引物设计的时候就注意到这一点的话，5‘和3’片段本身就能重叠，拼接起来就是了
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8楼2010-07-01 20:54:54
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
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8楼: Originally posted by ben1147 at 2010-07-01 20:54:54:
5‘ 的片段，用于设计引物的已知片段，3’片段，这三者肯定是能重叠的吧，三个拼起来，去掉重叠区就是全长了

更简单的情况下，引物设计的时候就注意到这一点的话，5‘和3’片段本身就能重叠，拼接起来就是了

想问一下拼接的片段就不需要验证了吗？验证的话，引物的设计上有什么要求吗？具体是上下游引物设计在什么位置的问题。。。
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9楼2011-11-21 14:41:33
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★
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西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-11-22 17:31:51
引用回帖:
9楼: Originally posted by 纳兰欣光 at 2011-11-21 14:41:33:
想问一下拼接的片段就不需要验证了吗？验证的话，引物的设计上有什么要求吗？具体是上下游引物设计在什么位置的问题。。。

当然要验证啦，拼起来的片段也许是来自两个同源基因或者等位基因的片段
直接P全长就能验证了么
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10楼2011-11-22 13:20:20
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