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【求助/交流】5-RACE问题 已有7人参与
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最近在做RACE，有些地方不太懂，请虫友赐教！！ 1.做5-RACE时，要先将RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基团，然后再去掉帽子，保留一个磷酸基团，那第一步“将RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基团，”是不是为了“去掉帽子”的需要？RNA的结构是怎么样的？ 2.接下来要加上接头引物，然后进行反转录反应，得到cDNA后，进行outer 和innner PCR，这里面的outer 和innner primer处在什么位置，它们离adaptor primer有多远啊，假如用outer primer扩出带后，那得到的这一段就是基因的5-末端吗，再往前就没有了吗？ 谢谢！！！ 还有一个问题，5-RACE得到基因的5-末端后，与3-端结合到一起形成一个完整的基因，它的结构除了ORF还有有哪些，5-端有没有启动子等结构， [ Last edited by 小猫三两只 on 2010-7-1 at 12:15 ] |
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3楼2010-07-01 12:07:20
won7
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看天(金币+2):谢谢交流 2010-06-30 21:50:54
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1，你所说的RACE是RLM-RACE法，第一步“将RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基团，”不是为了去帽子，是为了把不完整的mRNA和非mRNA的磷酸基团去掉，这样遮些RNA将无法与接头连接，从而提高5RACE的效率，保证得到的片段都是完整的。这与SMART-RACE不同。帽子结构有3个磷酸基团（不完整的mRNA和非mRNA的没有帽子结构），去帽子时只去掉两个基团，保留一个，这是连接接头必须的。 2， outer 和innner primer都是在接头的位置，只是innner primer在outer primer前面一些碱基。从原理得知，用这个方法得到的是完整的5-末端，前面没有了。 [ Last edited by won7 on 2010-6-30 at 21:53 ] |
2楼2010-06-30 21:49:44
won7
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小猫三两只(金币+5):非常感谢,现在清楚了 2010-07-01 15:35:18
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1,碱性磷酸酶能把裸露的磷酸基团去掉，而完整的mRNA 5末端有帽子结构保护，不能被去掉,用烟草酸焦磷酸酶可以去掉头两个磷酸，留下一个，便于与接头连接。 完整mRNA: m7G-p-p-p-----------------------------------AAAAAAAA 不完整mRNA: PO4---------------------------------------AAAAAAAAAA 2，outer 和inner primer 不是在接头附近，而是在接头上。接头也是一段RNA，接头的序列是知道的，outer 和inner prime的序列也知道，试剂盒说明书提供序列，可以查看。由于接头是RNA，所以不能直接作引物，下游肯定是GSP了。 3，启动子序列是不被转录的，完整的mRNA不会有启动子序列。 [ Last edited by won7 on 2010-7-1 at 12:48 ] |
4楼2010-07-01 12:45:48
5楼2010-07-01 15:37:05
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