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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】5-RACE问题
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】5-RACE问题已有7人参与

最近在做RACE，有些地方不太懂，请虫友赐教！！
1.做5-RACE时，要先将RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基团，然后再去掉帽子，保留一个磷酸基团，那第一步“将RNA去磷酸化，去掉裸露的磷酸基团，”是不是为了“去掉帽子”的需要？RNA的结构是怎么样的？
2.接下来要加上接头引物，然后进行反转录反应，得到cDNA后，进行outer 和innner PCR，这里面的outer 和innner primer处在什么位置，它们离adaptor primer有多远啊，假如用outer primer扩出带后，那得到的这一段就是基因的5-末端吗，再往前就没有了吗？
谢谢！！！


还有一个问题，5-RACE得到基因的5-末端后，与3-端结合到一起形成一个完整的基因，它的结构除了ORF还有有哪些，5-端有没有启动子等结构，

[ Last edited by 小猫三两只 on 2010-7-1 at 12:15 ]
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1楼2010-06-30 18:08:47
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by ben1147 at 2010-07-01 20:54:54:
5‘ 的片段，用于设计引物的已知片段，3’片段，这三者肯定是能重叠的吧，三个拼起来，去掉重叠区就是全长了

更简单的情况下，引物设计的时候就注意到这一点的话，5‘和3’片段本身就能重叠，拼接起来就是了

想问一下拼接的片段就不需要验证了吗？验证的话，引物的设计上有什么要求吗？具体是上下游引物设计在什么位置的问题。。。
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9楼2011-11-21 14:41:33
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by ben1147 at 2011-11-22 13:20:20:
当然要验证啦，拼起来的片段也许是来自两个同源基因或者等位基因的片段
直接P全长就能验证了么

还是想问一下P全长引物的设计都有什么要求，从起始密码子开始到终止密码子结束吗？比如说上有引物从ATG开始数20几个碱基？最近验证全长，P不出来，用的是TAKARA的M-MLV反转录酶，基因全长2300bp,想问一下是不是反转录酶的问题呢？
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11楼2011-11-22 15:00:46
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
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12楼: Originally posted by ben1147 at 2011-11-22 18:11:54:
2.3k不算长，引物也没什么要特别注意的。P不出来是不是RNA质量不好？一般问题出在反转本身很少见，尤其在5‘降解比较厉害的时候

至于P多长，当然是越长越好了，至少要包括ORF，毕竟全长片段拿到了，以后要做克 ...

谢谢了。。。
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13楼2011-11-23 10:14:52
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