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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)

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10楼: Originally posted by ben1147 at 2011-11-22 13:20:20:
当然要验证啦，拼起来的片段也许是来自两个同源基因或者等位基因的片段
直接P全长就能验证了么

还是想问一下P全长引物的设计都有什么要求，从起始密码子开始到终止密码子结束吗？比如说上有引物从ATG开始数20几个碱基？最近验证全长，P不出来，用的是TAKARA的M-MLV反转录酶，基因全长2300bp,想问一下是不是反转录酶的问题呢？

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11楼2011-11-22 15:00:46

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ben1147

木虫 (正式写手)

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西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！相比反转录本身，RNA更可能出问题！ 2011-11-23 17:51:51

引用回帖:

11楼: Originally posted by 纳兰欣光 at 2011-11-22 15:00:46:
还是想问一下P全长引物的设计都有什么要求，从起始密码子开始到终止密码子结束吗？比如说上有引物从ATG开始数20几个碱基？最近验证全长，P不出来，用的是TAKARA的M-MLV反转录酶，基因全长2300bp,想问一下是不是反 ...

2.3k不算长，引物也没什么要特别注意的。P不出来是不是RNA质量不好？一般问题出在反转本身很少见，尤其在5‘降解比较厉害的时候

至于P多长，当然是越长越好了，至少要包括ORF，毕竟全长片段拿到了，以后要做克隆什么的也有用。不一定非要卡着ATG，往上游走也可以，给引物设计留的余地大一点，多搞几对，没准哪对就能出来

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纳兰欣光

12楼2011-11-22 18:11:54

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纳兰欣光

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引用回帖:

12楼: Originally posted by ben1147 at 2011-11-22 18:11:54:
2.3k不算长，引物也没什么要特别注意的。P不出来是不是RNA质量不好？一般问题出在反转本身很少见，尤其在5‘降解比较厉害的时候

至于P多长，当然是越长越好了，至少要包括ORF，毕竟全长片段拿到了，以后要做克 ...

谢谢了。。。

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13楼2011-11-23 10:14:52

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