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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3‘race 求助，急
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yiyi12

银虫 (小有名气)

[求助] 3‘race 求助，急

最近一直做一基因家族成员的3’race，有3条，一条做出了全长，一条得到了中间片段和3’，还有一条只有中间片段。前面那些是师姐做的，我要做出来全长，可是最后这个的3’一直做不出来。用的是takara 3‘full race试剂盒。以前跑巢式都只有引物二聚体，现在是图片中显示的情况。请问是不是非特异扩增？怎样减少？用的温度梯度。



[ Last edited by yiyi12 on 2012-5-7 at 21:03 ]
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1楼 2012-05-07 21:01:37
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小猫三两只

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, 鼓励应助 2012-05-08 13:50:52
yiyi12: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-10 22:25:48
你做内向PCR了没，外向有时都会出现这种情况，再做一下内向就行了。
3-RACE相对来说要好做的多，以前我也用宝生物的试剂盒，没出过问题。但现在都是直接合成引物，反转录后直接扩增，现在告诉楼主一种新方法：
QT：CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTT TTTTTTT
Q0：CCAGTGAGCAGAGTGACG
Q1：GAGGACTCGAGCTCAAGC
因为RNA的3末端加有polyA尾巴，，用上面加一通用引物的QT引物做反转录，也即取代之前的Oligo dT，得到的cDNA除了有poly(T)外，还有两个通用引物，然后用Q0作外向PCR，Q1做内向PCR，上游引物用你的基因特异性引物就行了。
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3楼2012-05-08 09:03:42
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普通回帖

hellolin

金虫 (小有名气)
各个泳道分别是什么啊~
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scienceguy
2楼2012-05-07 23:24:15
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yiyi12

银虫 (小有名气)
西瓜: 回帖置顶 2012-05-12 23:04:03
内轮pcr产物。用的温度梯度跑的。每个泳道对应一个温度。目的产物大约应该是900左右。
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4楼2012-05-08 10:32:09
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yiyi12

银虫 (小有名气)
内轮pcr产物。用的温度梯度跑的。每个泳道对应一个温度。目的产物大约应该是900左右。
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5楼2012-05-08 10:33:31
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yiyi12

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hellolin at 2012-05-07 23:24:15:
各个泳道分别是什么啊~

内轮pcr产物。用的温度梯度跑的。每个泳道对应一个温度。目的产物大约应该是900左右。
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6楼2012-05-08 10:33:39
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yiyi12

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-05-08 09:03:42:
你做内向PCR了没，外向有时都会出现这种情况，再做一下内向就行了。
3-RACE相对来说要好做的多，以前我也用宝生物的试剂盒，没出过问题。但现在都是直接合成引物，反转录后直接扩增，现在告诉楼主一种新方法：
...

这个方法看起来不错啊。试剂盒的接头太少了。因为不止我自己用，所以做的时候不敢大胆地做。楼主这方法有什么出处不？到时候引用也方便。
    我的电泳图用的就是内轮产物跑的。这已经是我设计引物的最内轮了。
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7楼2012-05-08 10:37:08
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zhengli123

金虫 (小有名气)
说实话，胶跑的也不好
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8楼2012-05-08 19:35:01
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linyanfei

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-09 13:49:50
Takara 的3‘RACE试剂盒没问题的呀，我之前也一直用那个试剂盒，可能是你的特异引物设计的不太好吧？重新换一下特异引物了，做分子就是这样子的，呵呵，祝楼主实验顺利
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9楼2012-05-08 21:47:23
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-09 13:49:59
yiyi12: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-10 22:26:15
我们实验室做3race都是自己合成带T的接头呢，不用试剂盒，在反转的时候注意使用oligodT就好了，楼主最好多设计几个上游引物，多做几次巢式PCR，如果还不行的话，检查一下RNA质量有没有问题
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10楼2012-05-09 08:51:34
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