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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3‘s race PCR问题
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摩都520

铜虫 (小有名气)

[求助] 3‘s race PCR问题

求助哪个伙伴帮分析，我的prog是
94C 3min
94   30s
55   30s
72   90s
72   3min
4     1min
然后开始是35循环，二次PCR是38循环，有很多杂带，有一条杂带1000多很亮，目的带没有（估计目的带为400）
然后听同学建议，二次PCR跑的55循环，还是很多杂带，仍一带带1000多很亮，

第三次实验，是一次PCR，45循环，仍杂带，目的带无，有一条1000多亮杂带。

求哪位大伙伴，小伙伴帮助！！！我是新虫，不懂还请指教
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只做一件事，做绝
1楼 2013-08-04 00:18:27
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
摩都520(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-04 12:02:00
退火温度向高地提一下试试，没做巢式么？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-08-04 01:30:36
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-04 12:02:07
如果模板为cDNA 预变性40 S足够了哈！当然这不重要，做race的时候获得多条带非常正常，一般取长者测序，不过我不明白的是，既然是race，你怎么知道目的带大小呢？
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互助互励，共奋共进！！
3楼2013-08-04 04:08:56
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 04:08:56
如果模板为cDNA 预变性40 S足够了哈！当然这不重要，做race的时候获得多条带非常正常，一般取长者测序，不过我不明白的是，既然是race，你怎么知道目的带大小呢？

嗯，我做的是鱼，这条鱼的基因组已经出来了，采用的是NCBI预测序列，1428bp，
PREDICTED: Oreochromis niloticus peroxisome proliferator-activated receptor alpha-like, transcript variant 2 (LOC100697805), mRNA
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只做一件事，做绝
4楼2013-08-04 19:56:57
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Fleaves at 2013-08-04 01:30:36
退火温度向高地提一下试试，没做巢式么？

嗯，没摸梯度，依经验另一个同学做的同一功能作用相反的基因，二次PCR做的就是巢式。他做5 RACE的提高了退火温度，做出的
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只做一件事，做绝
5楼2013-08-04 20:01:46
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 摩都520 at 2013-08-04 19:56:57
嗯，我做的是鱼，这条鱼的基因组已经出来了，采用的是NCBI预测序列，1428bp，
PREDICTED: Oreochromis niloticus peroxisome proliferator-activated receptor alpha-like, transcript variant 2 (LOC100697805), ...

那直接设计对特异引物就好，没必要race啊！
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互助互励，共奋共进！！
6楼2013-08-04 23:26:17
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个显然退货温度低了阿
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7楼2013-08-05 09:21:27
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 23:26:17
那直接设计对特异引物就好，没必要race啊！...

还是要的，只是基因组知道，但具体各个基因序列还不能推测，据说预测的只是通过基因软件得到很多基因序列，然后这些基因序列跟其它相近物种已知基因比，发现这个基因序列正好跟其它鱼的这个基因PPAR像，就预测认为这个序列也是PPAR基因。

但是软件得到的只是编码区序列，而可能3‘端还有很长非编码区基因还不知道。所以要跑RACE

不知以上我这个听来的解释对不对？

大谢回复！！！！
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只做一件事，做绝
8楼2013-08-05 17:00:20
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by grape_vine at 2013-08-05 09:21:27
这个显然退货温度低了阿

嗯，我也怀疑过是退火温度。用的是天根的试剂盒，里面就是是55C（附图中显示）

我问过我同学，他说一般不摸退火温度（比较费模板cDNA）。


所以现在也只能怀疑是退火温度。


大谢回复哦～因为我刚学做，然后想摸退火温度，首先想更加确定分析出最可能原因，其次而这样比较费模板cDNA。

每次反转录得到10微升，模板三个引物，要4微升。跑两次outer就没了。

当然经过大家分析假如最可能是退火温度，是必然会摸温度的。
3‘s race PCR问题
IMG_20130805_170102.jpg
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只做一件事，做绝
9楼2013-08-05 17:09:39
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Fleaves at 2013-08-04 01:30:36
退火温度向高地提一下试试，没做巢式么？


左边三道是引物 1    2    3的产物（这是outer的，稍后上传inner的）
很多杂带         右边很亮的是内参基因
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只做一件事，做绝
10楼2013-08-05 17:37:40
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