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摩都520

铜虫 (小有名气)

[求助] 3‘s race PCR问题

求助哪个伙伴帮分析,我的prog是
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然后开始是35循环,二次PCR是38循环,有很多杂带,有一条杂带1000多很亮,目的带没有(估计目的带为400)
然后听同学建议,二次PCR跑的55循环,还是很多杂带,仍一带带1000多很亮,

第三次实验,是一次PCR,45循环,仍杂带,目的带无,有一条1000多亮杂带。

求哪位大伙伴,小伙伴帮助!!!我是新虫,不懂还请指教
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只做一件事,做绝
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
摩都520(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-04 12:02:00
退火温度向高地提一下试试,没做巢式么?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2013-08-04 01:30:36
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-04 12:02:07
如果模板为cDNA 预变性40 S足够了哈!当然这不重要,做race的时候获得多条带非常正常,一般取长者测序,不过我不明白的是,既然是race,你怎么知道目的带大小呢?
互助互励,共奋共进!!
3楼2013-08-04 04:08:56
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摩都520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 04:08:56
如果模板为cDNA 预变性40 S足够了哈!当然这不重要,做race的时候获得多条带非常正常,一般取长者测序,不过我不明白的是,既然是race,你怎么知道目的带大小呢?

嗯,我做的是鱼,这条鱼的基因组已经出来了,采用的是NCBI预测序列,1428bp,
PREDICTED: Oreochromis niloticus peroxisome proliferator-activated receptor alpha-like, transcript variant 2 (LOC100697805), mRNA
只做一件事,做绝
4楼2013-08-04 19:56:57
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摩都520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Fleaves at 2013-08-04 01:30:36
退火温度向高地提一下试试,没做巢式么?

嗯,没摸梯度,依经验另一个同学做的同一功能作用相反的基因,二次PCR做的就是巢式。他做5 RACE的提高了退火温度,做出的
只做一件事,做绝
5楼2013-08-04 20:01:46
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 摩都520 at 2013-08-04 19:56:57
嗯,我做的是鱼,这条鱼的基因组已经出来了,采用的是NCBI预测序列,1428bp,
PREDICTED: Oreochromis niloticus peroxisome proliferator-activated receptor alpha-like, transcript variant 2 (LOC100697805), ...

那直接设计对特异引物就好,没必要race啊!
互助互励,共奋共进!!
6楼2013-08-04 23:26:17
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这个显然退货温度低了阿
7楼2013-08-05 09:21:27
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摩都520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 23:26:17
那直接设计对特异引物就好,没必要race啊!...

还是要的,只是基因组知道,但具体各个基因序列还不能推测,据说预测的只是通过基因软件得到很多基因序列,然后这些基因序列跟其它相近物种已知基因比,发现这个基因序列正好跟其它鱼的这个基因PPAR像,就预测认为这个序列也是PPAR基因。

但是软件得到的只是编码区序列,而可能3‘端还有很长非编码区基因还不知道。所以要跑RACE

不知以上我这个听来的解释对不对?

大谢回复!!!!
只做一件事,做绝
8楼2013-08-05 17:00:20
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摩都520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by grape_vine at 2013-08-05 09:21:27
这个显然退货温度低了阿

嗯,我也怀疑过是退火温度。用的是天根的试剂盒,里面就是是55C(附图中显示)

我问过我同学,他说一般不摸退火温度(比较费模板cDNA)。


所以现在也只能怀疑是退火温度。


大谢回复哦~因为我刚学做,然后想摸退火温度,首先想更加确定分析出最可能原因,其次而这样比较费模板cDNA。

每次反转录得到10微升,模板三个引物,要4微升。跑两次outer就没了。

当然经过大家分析假如最可能是退火温度,是必然会摸温度的。
3‘s race PCR问题
IMG_20130805_170102.jpg

只做一件事,做绝
9楼2013-08-05 17:09:39
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摩都520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Fleaves at 2013-08-04 01:30:36
退火温度向高地提一下试试,没做巢式么?


左边三道是引物 1    2    3的产物(这是outer的,稍后上传inner的)
很多杂带         右边很亮的是内参基因
只做一件事,做绝
10楼2013-08-05 17:37:40
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