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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3‘s race PCR问题
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

inner做完还这样的话，实在不行就切胶吧
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11楼2013-08-05 20:30:34
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 摩都520 at 2013-08-05 17:37:40
http://bcs.duapp.com/emuchnet/weixin/6c/db/78913d2cee506a36cdba15e1b6cd8c78.jpg
左边三道是引物 1    2    3的产物（这是outer的，稍后上传inner的）
很多杂带         右边很亮的是内参基因...

用新提RNA反转的cDNA 重做的3 RACE 原20微升体系 和 program做的
outer 40cycles
inner 50cycles


这MARKER右边 第1 2 道是跑出来了吗？
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只做一件事，做绝
12楼2013-08-05 21:56:19
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cnliu51

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 22:13:31
我做3'RACE时遇到过同样情况，建议先将最亮的那一条带切胶纯化然后测序。如果测序结果包含了你的已知序列，则用可根据得到新序列再设计out和inner引物进行二次3'RACE。原因：3RACE的反转录引物中含有polyT，如果3'端有富含A的序列（3'段这种序列较常见），则这一引物可能与其结合，产生的片段就不是真正的3'RACE，但已经接近了。产生这一现象的原因还有另外几方面可能：1.这个基因3'RACE预测长度不准，物种间同一基因的3'UTR不尽相同。2.这个基因的3'UTR存在多样性，这在基因中很常见，但国内做克隆时时常被忽略，这些不同长度的3'UTR可能与该基因的转录调控有关。不管是哪一种原因，先主带测序是个好的选择。
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13楼2013-08-06 06:25:39
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cnliu51

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 22:13:39
还有一点要说明，感觉你的PCR的循环数太多了。我用的是TAKARA的盒子，一般OUT用25个循环，INNER用33个。这本来就是巢式反应，INNER根本用不着这么多循环，循环数多了容易产生非特异条带。
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14楼2013-08-06 06:30:47
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by cnliu51 at 2013-08-06 06:30:47
还有一点要说明，感觉你的PCR的循环数太多了。我用的是TAKARA的盒子，一般OUT用25个循环，INNER用33个。这本来就是巢式反应，INNER根本用不着这么多循环，循环数多了容易产生非特异条带。

嗯，也怀疑过。但同学讲因为takara试剂盒的原理，是认为你的基因表达量相对高的情况下的，我的基因表达量假如不算太高的话，循环多点保险。这是跟有经验的同学请教的，以前他跑不出来，人家告诉他跑到45循环，PCR聚合酶的保真效果也还可以，基因表达量低，应该多跑点循环，所以。。。。。

现在新的问题是，昨天的跑胶图 20微升体系貌似跑出来了，200多bp。所以我今天又跑了一个30微升体系 同样的program 图却变了，变成了700－800bp，重复性没有出现，现在很纳闷（之前用内参基因看cDNA是否有基因组DNA污染，发现是有微弱的污染的）是否700－800bp是基因组DNA。


如上图，现在是送第一道700多bp和第4道200多bp去测序了，等结果。。。。。
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只做一件事，做绝
15楼2013-08-06 17:34:11
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by Fleaves at 2013-08-05 20:30:34
inner做完还这样的话，实在不行就切胶吧

嗯，现送一个去测。等明天测序结果
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只做一件事，做绝
16楼2013-08-06 18:46:06
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 04:08:56
如果模板为cDNA 预变性40 S足够了哈！当然这不重要，做race的时候获得多条带非常正常，一般取长者测序，不过我不明白的是，既然是race，你怎么知道目的带大小呢？

亲，谢谢，貌似我通过最后一张上传的跑胶图片，测序出来了
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只做一件事，做绝
17楼2013-08-07 23:18:17
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Fleaves at 2013-08-04 01:30:36
退火温度向高地提一下试试，没做巢式么？

亲，谢谢，貌似我通过最后一张上传的跑胶图片，测序出来了
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只做一件事，做绝
18楼2013-08-07 23:19:18
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by cnliu51 at 2013-08-06 06:25:39
我做3'RACE时遇到过同样情况，建议先将最亮的那一条带切胶纯化然后测序。如果测序结果包含了你的已知序列，则用可根据得到新序列再设计out和inner引物进行二次3'RACE。原因：3RACE的反转录引物中含有polyT，如果3'端 ...

亲，谢谢，貌似我通过最后一张上传的跑胶图片，测序出来了
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只做一件事，做绝
19楼2013-08-07 23:20:20
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
楼主可以加一下我吗？（1220118391）我是新手，刚开始做，想向高手请教一下
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
20楼2013-09-11 14:25:13
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