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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

inner做完还这样的话,实在不行就切胶吧
11楼2013-08-05 20:30:34
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摩都520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 摩都520 at 2013-08-05 17:37:40
http://bcs.duapp.com/emuchnet/weixin/6c/db/78913d2cee506a36cdba15e1b6cd8c78.jpg
左边三道是引物 1    2    3的产物(这是outer的,稍后上传inner的)
很多杂带         右边很亮的是内参基因...

用新提RNA反转的cDNA 重做的3 RACE 原20微升体系 和 program做的
outer 40cycles
inner 50cycles


这MARKER右边 第1 2 道是跑出来了吗?
只做一件事,做绝
12楼2013-08-05 21:56:19
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cnliu51

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2013-09-30 22:13:31
我做3'RACE时遇到过同样情况,建议先将最亮的那一条带切胶纯化然后测序。如果测序结果包含了你的已知序列,则用可根据得到新序列再设计out和inner引物进行二次3'RACE。原因:3RACE的反转录引物中含有polyT,如果3'端有富含A的序列(3'段这种序列较常见),则这一引物可能与其结合,产生的片段就不是真正的3'RACE,但已经接近了。产生这一现象的原因还有另外几方面可能:1.这个基因3'RACE预测长度不准,物种间同一基因的3'UTR不尽相同。2.这个基因的3'UTR存在多样性,这在基因中很常见,但国内做克隆时时常被忽略,这些不同长度的3'UTR可能与该基因的转录调控有关。不管是哪一种原因,先主带测序是个好的选择。
13楼2013-08-06 06:25:39
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cnliu51

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-09-30 22:13:39
还有一点要说明,感觉你的PCR的循环数太多了。我用的是TAKARA的盒子,一般OUT用25个循环,INNER用33个。这本来就是巢式反应,INNER根本用不着这么多循环,循环数多了容易产生非特异条带。
14楼2013-08-06 06:30:47
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摩都520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by cnliu51 at 2013-08-06 06:30:47
还有一点要说明,感觉你的PCR的循环数太多了。我用的是TAKARA的盒子,一般OUT用25个循环,INNER用33个。这本来就是巢式反应,INNER根本用不着这么多循环,循环数多了容易产生非特异条带。

嗯,也怀疑过。但同学讲因为takara试剂盒的原理,是认为你的基因表达量相对高的情况下的,我的基因表达量假如不算太高的话,循环多点保险。这是跟有经验的同学请教的,以前他跑不出来,人家告诉他跑到45循环,PCR聚合酶的保真效果也还可以,基因表达量低,应该多跑点循环,所以。。。。。

现在新的问题是,昨天的跑胶图 20微升体系貌似跑出来了,200多bp。所以我今天又跑了一个30微升体系 同样的program 图却变了,变成了700-800bp,重复性没有出现,现在很纳闷(之前用内参基因看cDNA是否有基因组DNA污染,发现是有微弱的污染的)是否700-800bp是基因组DNA。


如上图,现在是送第一道700多bp和第4道200多bp去测序了,等结果。。。。。
只做一件事,做绝
15楼2013-08-06 17:34:11
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摩都520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by Fleaves at 2013-08-05 20:30:34
inner做完还这样的话,实在不行就切胶吧

嗯,现送一个去测。等明天测序结果
只做一件事,做绝
16楼2013-08-06 18:46:06
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摩都520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 04:08:56
如果模板为cDNA 预变性40 S足够了哈!当然这不重要,做race的时候获得多条带非常正常,一般取长者测序,不过我不明白的是,既然是race,你怎么知道目的带大小呢?

亲,谢谢,貌似我通过最后一张上传的跑胶图片,测序出来了
只做一件事,做绝
17楼2013-08-07 23:18:17
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摩都520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Fleaves at 2013-08-04 01:30:36
退火温度向高地提一下试试,没做巢式么?

亲,谢谢,貌似我通过最后一张上传的跑胶图片,测序出来了
只做一件事,做绝
18楼2013-08-07 23:19:18
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摩都520

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by cnliu51 at 2013-08-06 06:25:39
我做3'RACE时遇到过同样情况,建议先将最亮的那一条带切胶纯化然后测序。如果测序结果包含了你的已知序列,则用可根据得到新序列再设计out和inner引物进行二次3'RACE。原因:3RACE的反转录引物中含有polyT,如果3'端 ...

亲,谢谢,貌似我通过最后一张上传的跑胶图片,测序出来了
只做一件事,做绝
19楼2013-08-07 23:20:20
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

楼主可以加一下我吗?(1220118391)我是新手,刚开始做,想向高手请教一下
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
20楼2013-09-11 14:25:13
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