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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3‘RACE inner PCR 电泳结果总是有弥散现象回收条带不成带状什么原因啊？
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)

[交流] 3‘RACE inner PCR 电泳结果总是有弥散现象回收条带不成带状什么原因啊？ 已有11人参与

采用65度退火温度跑两轮3‘RACE PCR 电泳条带多条，并且最大的条带上面很大的弥散带，用的是TAKARA 3‘RACE试剂盒，设计两条上游特异性引物相差117bp,设计原则按照说明书来的，想问问做过3‘RACE的前辈们，这到底什么原因啊？图1为pcr结果，图2为切胶回收结果。
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1楼 2011-09-09 09:10:34
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linqin1029

新虫 (初入文坛)
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wanhscn(金币+3): Good！ 2011-09-09 16:33:02
怎么，我看不了你的图片啊！ 我提几点建议吧！
1、3‘RACE 的引物一般在60度以上，而且两条引物TM值要相差几度。以便改变两轮PCR的退火温度。
2、两轮巢式PCR的退火温度也要有差异，第二轮PCR退火温度要比第一轮高。以便减少非特异性扩增。
3、第一轮的PCR循环数25轮就OK拉，以便减少非特异扩增。
4、第一轮PCR的产物一般稀释5~20倍作为第二轮PCR的模板，以便减少非特异的产物模板。
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2楼2011-09-09 10:00:52
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普通回帖

taigongzaici

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
换盒子－－－ｃｌｏｔｈｔｅｃｈ，用过的都说好
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3楼2011-09-09 14:55:33
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
dhd997: 引用回复，他会看到你的提问的 2011-09-10 07:49:30
谢谢前辈的回答！提取的总RNA 中有基因组DNA 污染会造成这样的结果吗？
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4楼2011-09-09 16:07:14
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+3): good 2011-09-09 18:13:26
引用回帖:
4楼: Originally posted by 纳兰欣光 at 2011-09-09 16:07:14:
谢谢前辈的回答！提取的总RNA 中有基因组DNA 污染会造成这样的结果吗？

那可能是两条带，一个cDNA扩出来的， 一个是基因组扩出来的（如果有内含子），不会出现这种模糊。
一般不是用DNase消化过吗，污染的可能性不高吧。
可以参照 沙发 的回答！

[ Last edited by wanhscn on 2011-9-9 at 16:32 ]
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真相是最大的奢侈品
5楼2011-09-09 16:29:51
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zheng20089829

木虫 (小有名气)
★ ★
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wanhscn:编辑内容 2011-09-09 18:03
wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-09-09 18:06:27
我用的是clonetech的盒子，用梯度降低退火温度试试（touch down）弥散我觉得问题也不大，你那个带还可以的，直接割胶去测序好了

[ Last edited by wanhscn on 2011-9-9 at 18:03 ]
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6楼2011-09-09 17:28:54
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★
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引用回帖:
6楼: Originally posted by zheng20089829 at 2011-09-09 17:28:54:
我用的是clonetech的盒子，用梯度降低退火温度试试（touch down）弥散我觉得问题也不大，你那个带还可以的，直接割胶去测序好了
[ Last edited by wanhscn on 2011-9-9 at 18:03 ]

你觉得他挖带回收的那个带是不是很弱？还不如PCR产物直接过柱后拿去测序？
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真相是最大的奢侈品
7楼2011-09-09 18:06:07
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linyanfei

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): good 2011-09-10 07:49:47
我也是用的TAKARA 3‘RACE试剂盒，你可以一轮PCR的时候做一个梯度，选出最佳温度，再扩二轮，一般来说特异引物扩增第二轮的时候都只有一个带了！
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8楼2011-09-09 20:11:26
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
前一次切胶回收后转化链接，做的菌落PCR用的引物还是第二次PCR的引物，可是结果出来都是比较小的片段，直接送去菌液测序结果为没有信号，所以我就认为是切胶回收的带像是弥散而不是单一带了，没有信号是浓度太小还是用引物也没有测序出结果呢？
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9楼2011-09-09 22:14:50
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)

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引用回帖:
9楼: Originally posted by 纳兰欣光 at 2011-09-09 22:14:50:
前一次切胶回收后转化链接，做的菌落PCR用的引物还是第二次PCR的引物，可是结果出来都是比较小的片段，直接送去菌液测序结果为没有信号，所以我就认为是切胶回收的带像是弥散而不是单一带了，没有信号是浓度太小还 ...

像这样，利用引用回复，会给被引用的人一个提示，可以及时反馈你的问题
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人生不过几十年，成败荣辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快乐最值钱，自古人间苦无边，看得高远境如仙，愿你不为凡事恼，轻松快乐每一天。
10楼2011-09-10 07:50:29
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