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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物电泳条带弥散？？？
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR产物电泳条带弥散？？？

我用的模板用其他PCR方法成功P出清晰的条带，但是现在做普通的PCR,不知道为什么条带是弥散的？

目的条带在300多bp,引物合成单上两条引物tm值一样，都为56度。
引物序列在NCBI上搜索过，没有与基因组上非目的序列非特异性结合的

反应体系是按照taq酶上的说明书设定的
94度3min,
94度30sec,56度30sec,72度1min,共30循环
72度7min

引物（10mM）2微升，dNTP(2.5mM)4微升，酶0.5微升，模板1微升


2%胶，110V，45min


marker跑的很清楚，没有弥散，应该不是电泳的问题，那么反应体系出了什么问题么？



[ Last edited by xwsooo on 2011-4-11 at 20:27 ]
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1楼 2011-04-11 19:47:37
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

rainwander

铁杆木虫 (知名作家)
★ ★ ★
xwsooo(金币+1): 2011-04-11 20:39:56
西瓜(金币+3): 鼓励。版主抽空来不容易。 2011-04-11 22:53:38
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-04-11 20:18:41:
这样呀？延伸长了容易弥散？

弥散

好多可能的因素呢

模板量、DNTPs、酶........
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4楼2011-04-11 20:26:15
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
镁离子、dNTP、引物、模板、酶太多，退火温度过低，都可能产生弥散，有时候引物质量不好也可能，通常我们p的时候镁离子、dNTP、引物、酶的量都是基本不变的，主要还是考虑模板浓度和引物的质量

1，模板浓度可能太大，建议稀释；
2，引物特异性不好，建议多设计几对引物进行扩增；
3，buffer和引物得等在冰上溶解后再使用；
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14楼2011-04-29 16:57:38
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超然渡陈

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能是退火温度的原因。有条件的话可以做一下梯度PCR找一下最佳退火温度。
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18楼2012-03-27 20:04:44
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普通回帖

rainwander

铁杆木虫 (知名作家)
无图无真相

延伸30s足够了
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2楼2011-04-11 20:17:10
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rainwander at 2011-04-11 20:17:10:
无图无真相

延伸30s足够了

这样呀？延伸长了容易弥散？
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3楼2011-04-11 20:18:41
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by rainwander at 2011-04-11 20:26:15:
弥散

好多可能的因素呢

模板量、DNTPs、酶........

我上了电泳图了
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5楼2011-04-11 20:37:12
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liugs

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-04-12 11:03:57
xwsooo(金币+1): 2011-04-12 11:54:39
本帖内容被屏蔽
6楼2011-04-12 09:39:43
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xwsooo

银虫 (小有名气)
现在还是这个问题木有解决，
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7楼2011-04-23 20:36:42
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-04-23 20:36:42:
现在还是这个问题木有解决，

引物一般用的是10 μM的吧？你的10 mM是写错了还是稀释错了……
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8楼2011-04-23 21:53:47
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流。个人认为这温度还行，呵呵~ 2011-04-23 22:00:34
xwsooo(金币+1): 感谢回复 2011-04-24 22:29:13
你的退火温度是不是有点高啊？
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9楼2011-04-23 21:58:14
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-23 21:53:47:
引物一般用的是10 μM的吧？你的10 mM是写错了还是稀释错了……

额，是滴，是10uM,是我写错咯
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10楼2011-04-24 09:55:28
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhangyonghu at 2011-04-23 21:58:14:
你的退火温度是不是有点高啊？

引物合成单上写的56度，高么
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11楼2011-04-24 09:56:01
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-04-25 21:56:01
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-04-24 09:56:01:
引物合成单上写的56度，高么

我觉得有点高了，你降一点试试
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12楼2011-04-25 21:07:45
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花的泪

银虫 (初入文坛)
30ul体系引物用1ul即可，模板也可降低
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13楼2011-04-29 16:38:36
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忆-雪

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也出现楼主电泳图的情况
我的PCR条件是：94度5min,
94度30sec,50度30sec,72度45S,共25循环
72度7min
dd水 8.5微升,引物1微升，2PCR Mix 10微升，模板0.5微升
1%胶，100-90V，45min
同样是marker条带清晰，样品条带跟楼主电泳一样，这是为什么呢
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15楼2012-03-26 12:43:28
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忆-雪

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也出现楼主一样的电泳情况
我的PCR条件是：94度5min,
94度30sec,50度30sec,72度45S,共25循环
72度7min
引物1ul，PCR Mix 1ul，模板0.5ul
1%胶，100-90V，45min
marker电泳条带，样品出现跟楼主一样的情况
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16楼2012-03-26 13:11:39
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chlorella409

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
延伸时间太长了吧，你用的聚合酶应该有延伸速度的啊，一般延伸1min都是P上千bp的目的带用的了，你的才300
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17楼2012-03-26 14:18:47
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我因为这个问题都纠缠了一个月了，每次PCR的结果都是弥散的。换了一种酶，结构内参组倒是出来目的条带，而实验组还是弥散的或者根本不出来，，，，，，，，，抓狂了
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19楼2012-06-28 16:20:20
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轻清1106

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，问题解决了吗？我也遇到了同样的问题。请赐教！
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20楼2012-10-02 09:47:17
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hjjzoe

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
先从退火温度和循环参数上着手。
退火温度可以做个梯度，我第一次PCR也是出现这问题，当时引物单上退火温度是57°C，P出来的图就跟楼主一样，按Tm-5°C也不行。后来做个梯度，最后选择的退火是61°C。
一般来说，taq酶的延伸速度大约1000bp/min，因此300bp，20秒就够，又省时间。
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21楼2012-10-02 13:28:11
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冰点可乐

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
还是体系的问题，你试着降低一些酶的浓度，你加完模板，配体系的时间是不是太长了，模板发生降解？
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22楼2013-01-29 20:40:27
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小康713

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
解决没有，我也是同样的情况
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23楼2014-04-06 13:22:30
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没有头的苍蝇

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也是，me too！！哪位大神给解决一下呢
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24楼2014-04-07 00:50:09
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不爱做实验

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也出现过这个问题，得到的解释是，没有P出来。。。我觉得还是注意一下药品用量，温度条件
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25楼2014-04-10 19:17:37
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dpzhaowei

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
遇到了同样的情况，条带本来能P出来很好的，第三次P就出现了弥散，反应条件和前期一样，更换了模板也害死不行。真心不知道怎么了。
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26楼2014-04-24 21:53:56
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cx菜菜

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by dpzhaowei at 2014-04-24 21:53:56
遇到了同样的情况，条带本来能P出来很好的，第三次P就出现了弥散，反应条件和前期一样，更换了模板也害死不行。真心不知道怎么了。

我也是遇到同样的问题，不知道你们怎么解决了
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27楼2015-08-10 19:56:24
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173734022

禁虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
28楼2016-01-08 20:26:14
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xbwstl88

新虫 (初入文坛)
DNA可能降解了

发自小木虫Android客户端
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29楼2016-01-08 21:32:17
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yao081408

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by dpzhaowei at 2014-04-24 21:53:56
遇到了同样的情况，条带本来能P出来很好的，第三次P就出现了弥散，反应条件和前期一样，更换了模板也害死不行。真心不知道怎么了。

一样本来跑的是没条带，然后现在一直是瀑布恶心死了，都不知道怎么回事，各种换各种试都没用
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30楼2016-01-19 14:53:20
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实验white

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也出现过这样的情况，不知你们现在解决了吗？

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31楼2017-11-24 22:15:50
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