[交流] 【求助/交流】AFLP选扩产物弥散，请做过AFLP的同行们耽误几分钟帮忙看看 已有4人参与

目前在做AFLP实验，就在选扩产物电泳时样品全部弥散，看了很多论坛包括小木虫，好像大多数人都是反映这个问题，难道就是AFLP里的哥德巴赫猜想？请做过这类实验并且成功的同行给仍然在黑暗里摸索的我们一点提示和建议，或许能让我们少走很多弯路，在此谢谢了！     标准菌株与样品DNA同时酶切、连接、稀释50倍后，25微升选择性扩增（没有预扩），之后60V，3个小时琼脂糖电泳，EB染色后，标准菌株条带清晰，但是样品的基本都是弥散条带，请教做过AFLP实验的达人们，发生这样情况的主要原因是什么？图1是样品的，图2是标准菌株的。      PS：之后把样品的连接产物稀释50，100和200倍，同时将mastermix（天根，2*）分12.5，10，6微升，再次做选择性扩增，仍然全部弥散。今天选择2个样品分别做以下操作： 1，退火温度提高5度，循环次数不变 2，循环次数减少到20个，退火温度不变 3，重新酶切、连接、稀释100倍，PCR 4，原来连接产物用醋酸铵、无水乙醇、70%乙醇纯化后，稀释100倍，PCR。       结果一句话：弥散。     后来纯化后稀释100，200，500，1000倍后，仍然是弥散，不过有1-2条的条带。     DNA加10倍loading buffer电泳有条带，酶切连接产物电泳有条带，不过比标准菌株的要暗。（当然，由于本人第一次做这类实验，到底酶切是否切开，尽管有电泳图，还不是非常的懂），图3为酶切连接电泳图     认为是DNA量少，加1，2，5微升直接PCR，仍然弥散     之后将mastermix改为15，20，22微升，还是弥散，满世界的弥散弥散弥散…………     所以就搞不明白了，同样一起反应的酶切，连接，PCR体系，前面十几个标准菌株全部有条带，到了样品立即就没有了，很是奇怪。 图1 标准菌株AFLP电泳图，不用解释了，2个样品间都是marker 图2 样品AFLP电泳图，也……不用解释了，弥散的都是样品 图3 酶切连接图，maker左边的是酶切，最亮的是标准菌株的；marker右边的是连接，最亮的也是标准菌株的，是同一菌株用新旧试剂，结果标准菌株仍然有很好的条带，而样品没有 [ Last edited by lstt09nk on 2010-10-19 at 11:12 ]

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