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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有做AFLP的么？
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)

[求助] 有做AFLP的么？

最近老师让做AFLP。我一点也不了解，好做么？我看还得酶切什么的，好像很麻烦的！这个实验的成功率怎么样?以后号处理么？
好心人帮帮我吧，有相关的东西给我发一下，我的邮箱是：zhangyonghu0815@126.com
谢谢了，就算是救命吧！呵呵
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1楼 2011-07-15 22:09:03
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genewind

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

请问你要做什么的AFLP？
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2楼2011-07-15 22:30:43
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genewind

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流。可否贴出来呢？方便所有人啊，呵呵 2011-07-15 23:25:31
zhangyonghu(金币+2): 谢谢。我看了，就是英文的看的不太懂 2011-07-17 14:34:34
已发送到你邮箱不知是不是你需要的
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3楼2011-07-15 22:36:17
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liugs

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
4楼2011-07-17 09:41:04
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云横秦岭

铁杆木虫 (正式写手)
有软件吗？genescan，binthere，等等，有的话给我发一份
邮箱sososolylyly@yahoo.com.cn，先谢了
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5楼2011-09-28 08:42:06
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另一个天堂

金虫 (小有名气)
挺麻烦的，而且很多药品有毒，过程很繁琐，需要自己慢慢掌握
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6楼2011-09-30 14:44:03
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
Protocol
3.1 实验材料
3.1.1材料
第2章提取的mtDNA
3.1.2仪器
Eppendorf 离心机
T-Gradient Thermoblock PCR扩增仪（Biometra公司）；
Siqu-Gen Cell 38×30垂直电泳仪（Bio-Rad公司）；国产北京六一厂垂直电泳仪
PowerPca3000电泳电源（Bio-Rad公司）；
PowerPca300电泳电源、Bio-Rad公司水平电泳槽（Bio-Rad公司）；
凝胶电泳成像系统（Bio-Rad公司）
3.1.3 药品
Tri、EDTA、硼酸、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、超纯尿素、PCR相关试剂为进口或进口分装；过硫酸胺、MgCl2、冰醋酸、甲醛、NaOH、Na2CO3、硝酸银及其它试剂均为国产分析纯。
3.2 实验方法
3.2.1 水稻mtDNA基因组的酶切
每个DNA样品酶切的混合液包括：
DNA（100ng/μl）                                5μl
MseⅠ                                                   5单位
EcoRI                                                         5单位
Y+/TANGOTMBuffer                                   8μl
加ddH2O至40μl
37℃酶切2h，65℃酶切2h，85℃灭活15min。
3.2.2 DNA片段接头的连接
酶切完成的每个DNA样品，加入如下反应液：
EcoRⅠ接头（5Pmol/μl）                      1.0μl
MseⅠ接头（50Pmol/μl）                           1.0μl
ATP（10mM）                                              1.0μl
T4-DNA连接酶（10U/μl）                           0.1μl
Y+/TANGOTMBuffer                                              2.0μl
ddH2O                                                              4.9μl  
                             共10μl
22℃连接过夜，取5ul样品用琼脂糖电泳检测，其余保存备用。
3.2.3 引物的筛选
将各种引物分别与已知的mtDNA样本进行PCR预扩和选扩，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，观察特异性条带，特异性条带较多(一般3-5个)者，则为较好引物，可用作本实验的扩增引物。
3.2.4 DNA片段的预扩增
连接产物用10mMTris-HCl、0.1mMEDTA（PH8.0）混合液稀释10倍。再加入如下体系进行PCR扩增：
DNA：                5μl
EcoRⅠ-MR：                    0.1μl
MseⅠ-MR：                        1μl
PCR mix：                           12.5μl
ddH2O        ：                                 6.4μl   
                   共25μl
混合后，在如下PCR条件下扩增：
step1                                                94℃                        30sec
    step2                                                56℃                        30sec
    step3                                                72℃                        1min
    step4                                                go to 1 for 30 cycles
    step5                                                4℃                                forever
预扩增完成后，取5μl预扩增产物，在1.0%琼脂糖凝胶中检测预扩增的效果，将余下物-20℃保存。
3.2.5 DNA片段的选择性扩增
预扩产物加ddH2O稀释10倍，再按下列体系配制混合液，准备PCR扩增：
DNA：              5μl
EcoR-P：          0.1μl
Mse-P：             1μl
dNTPs：            0.5μl
10×buffer：         2.5μl
Tap酶：            0.5μl
ddH2O：           15.4μl  
共25μl
PCR扩增程序如下：
step1                                                94℃                                30sec
    step2                                                65℃                                30sec(-0.7℃/cycle)
    step3                                                72℃                                1min
    step4                                        go to 1 for 11 cycles
    step5                                                94℃                                30sec
    step6                                                56℃                                30sec
    step7                                                72℃                                1min
    step8                                        go to 5 for 22 cycles
    step9                                                4℃                                        forever
3.2.6 聚丙烯酰胺变性凝胶电泳
将玻璃板用洗洁精彻底洗净，用酒精擦干、干燥。其中一块玻璃板（底板）涂上1ml剥离硅烷，另一块玻璃板（盖板）涂上0.5%亲和硅烷（1ml 95％乙醇，5ul冰醋酸，5μl 亲和硅烷；涂一块玻璃板用量用随配）。操作过程中，严格防止两块玻璃板互相污染，电吹风吹干，干燥后进行电泳槽组装，组装时用水平仪检测水平。将6%丙烯酰胺胶储存液（丙烯酰氨58g、10 × TBE 缓冲液、100ml、尿素480g、甲叉丙稀酰氨、2g）按如下比例配置：
6%PA胶                                              100ml
   10%过硫酸铵（AP）                                500μl
   TEMED                                                        100μl
轻轻摇匀后，迅速将胶沿灌胶口边灌边轻轻敲打，防止出现气泡。待胶流动到底部时，在灌胶口轻轻插入梳子，让其聚合至少1h（若让胶过夜，在胶的两头铺上保湿膜或盖上湿毛巾以防止胶干）。
70W恒功率电泳30min，使胶的温度高于45℃，清除气泡。取5l选扩产物与等体积变性Loading Buffer（去离子甲酰氨49 ml、0.5 M EDTA1ml、溴酚兰50mg、二甲苯氰50mg）混合，95℃变性10min后，迅速转移冰浴10min后点样，70W恒功率电泳至第二条带（二甲苯氰）至胶板的底沿（约2h）。电泳结束冷却后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴涂有亲和硅烷的玻璃板上。
3.2.7银染
脱色：取合适大小的塑料盒，倒入2L新配制的10%冰醋酸溶液(固定/停止液)，轻轻摇动5min。
漂洗：用蒸馏水（约2L）浸没玻璃板在摇床上漂洗胶板3次，每次2分钟。
染色：染色液（1.5g 硝酸银加入2L水）中，取出玻璃板快速浸入染色液中，摇床上轻轻摇动染色5min。
冲洗：用蒸馏水冲洗胶板不超过5sec。
显影： 2L显影液（30gNaOH加入2L水中，事先轻摇使之溶解，）加入37%甲醛8ml，把胶板快速转移到显影显影液中，并轻轻摇动，直到带纹出现。
定影：加入10%冰醋酸固定/停止液并轻摇3min。
冲洗：用蒸馏水冲洗2min
干燥：室温下自然干燥
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真相是最大的奢侈品
7楼2011-09-30 15:14:07
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