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zhangyonghu木虫 (小有名气)
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[求助]
有做AFLP的么？
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最近老师让做AFLP。我一点也不了解，好做么？我看还得酶切什么的，好像很麻烦的！这个实验的成功率怎么样?以后号处理么？ 好心人帮帮我吧，有相关的东西给我发一下，我的邮箱是：zhangyonghu0815@126.com 谢谢了，就算是救命吧！呵呵 |
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2楼2011-07-15 22:30:43
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wanhscn
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Protocol 3.1 实验材料 3.1.1材料 第2章提取的mtDNA 3.1.2仪器 Eppendorf 离心机 T-Gradient Thermoblock PCR扩增仪（Biometra公司）； Siqu-Gen Cell 38×30垂直电泳仪（Bio-Rad公司）；国产北京六一厂垂直电泳仪 PowerPca3000电泳电源（Bio-Rad公司）； PowerPca300电泳电源、Bio-Rad公司水平电泳槽（Bio-Rad公司）； 凝胶电泳成像系统（Bio-Rad公司） 3.1.3 药品 Tri、EDTA、硼酸、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、超纯尿素、PCR相关试剂为进口或进口分装；过硫酸胺、MgCl2、冰醋酸、甲醛、NaOH、Na2CO3、硝酸银及其它试剂均为国产分析纯。 3.2 实验方法 3.2.1 水稻mtDNA基因组的酶切 每个DNA样品酶切的混合液包括： DNA（100ng/μl） 5μl MseⅠ 5单位 EcoRI 5单位 Y+/TANGOTMBuffer 8μl 加ddH2O至40μl 37℃酶切2h，65℃酶切2h，85℃灭活15min。 3.2.2 DNA片段接头的连接 酶切完成的每个DNA样品，加入如下反应液： EcoRⅠ接头（5Pmol/μl） 1.0μl MseⅠ接头（50Pmol/μl） 1.0μl ATP（10mM） 1.0μl T4-DNA连接酶（10U/μl） 0.1μl Y+/TANGOTMBuffer 2.0μl ddH2O 4.9μl 共10μl 22℃连接过夜，取5ul样品用琼脂糖电泳检测，其余保存备用。 3.2.3 引物的筛选 将各种引物分别与已知的mtDNA样本进行PCR预扩和选扩，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，观察特异性条带，特异性条带较多(一般3-5个)者，则为较好引物，可用作本实验的扩增引物。 3.2.4 DNA片段的预扩增 连接产物用10mMTris-HCl、0.1mMEDTA（PH8.0）混合液稀释10倍。再加入如下体系进行PCR扩增： DNA： 5μl EcoRⅠ-MR： 0.1μl MseⅠ-MR： 1μl PCR mix： 12.5μl ddH2O ： 6.4μl 共25μl 混合后，在如下PCR条件下扩增： step1 94℃ 30sec step2 56℃ 30sec step3 72℃ 1min step4 go to 1 for 30 cycles step5 4℃ forever 预扩增完成后，取5μl预扩增产物，在1.0%琼脂糖凝胶中检测预扩增的效果，将余下物-20℃保存。 3.2.5 DNA片段的选择性扩增 预扩产物加ddH2O稀释10倍，再按下列体系配制混合液，准备PCR扩增： DNA： 5μl EcoR-P： 0.1μl Mse-P： 1μl dNTPs： 0.5μl 10×buffer： 2.5μl Tap酶： 0.5μl ddH2O： 15.4μl 共25μl PCR扩增程序如下： step1 94℃ 30sec step2 65℃ 30sec(-0.7℃/cycle) step3 72℃ 1min step4 go to 1 for 11 cycles step5 94℃ 30sec step6 56℃ 30sec step7 72℃ 1min step8 go to 5 for 22 cycles step9 4℃ forever 3.2.6 聚丙烯酰胺变性凝胶电泳 将玻璃板用洗洁精彻底洗净，用酒精擦干、干燥。其中一块玻璃板（底板）涂上1ml剥离硅烷，另一块玻璃板（盖板）涂上0.5%亲和硅烷（1ml 95％乙醇，5ul冰醋酸，5μl 亲和硅烷；涂一块玻璃板用量用随配）。操作过程中，严格防止两块玻璃板互相污染，电吹风吹干，干燥后进行电泳槽组装，组装时用水平仪检测水平。将6%丙烯酰胺胶储存液（丙烯酰氨58g、10 × TBE 缓冲液、100ml、尿素480g、甲叉丙稀酰氨、2g）按如下比例配置： 6%PA胶 100ml 10%过硫酸铵（AP） 500μl TEMED 100μl 轻轻摇匀后，迅速将胶沿灌胶口边灌边轻轻敲打，防止出现气泡。待胶流动到底部时，在灌胶口轻轻插入梳子，让其聚合至少1h（若让胶过夜，在胶的两头铺上保湿膜或盖上湿毛巾以防止胶干）。 70W恒功率电泳30min，使胶的温度高于45℃，清除气泡。取5l选扩产物与等体积变性Loading Buffer（去离子甲酰氨49 ml、0.5 M EDTA1ml、溴酚兰50mg、二甲苯氰50mg）混合，95℃变性10min后，迅速转移冰浴10min后点样，70W恒功率电泳至第二条带（二甲苯氰）至胶板的底沿（约2h）。电泳结束冷却后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴涂有亲和硅烷的玻璃板上。 3.2.7银染 脱色：取合适大小的塑料盒，倒入2L新配制的10%冰醋酸溶液(固定/停止液)，轻轻摇动5min。 漂洗：用蒸馏水（约2L）浸没玻璃板在摇床上漂洗胶板3次，每次2分钟。 染色：染色液（1.5g 硝酸银加入2L水）中，取出玻璃板快速浸入染色液中，摇床上轻轻摇动染色5min。 冲洗：用蒸馏水冲洗胶板不超过5sec。 显影： 2L显影液（30gNaOH加入2L水中，事先轻摇使之溶解，）加入37%甲醛8ml，把胶板快速转移到显影显影液中，并轻轻摇动，直到带纹出现。 定影：加入10%冰醋酸固定/停止液并轻摇3min。 冲洗：用蒸馏水冲洗2min 干燥：室温下自然干燥 |
7楼2011-09-30 15:14:07
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