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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » AFLP酶切连接 求高人指点啊
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wskxbxf

新虫 (小有名气)

[交流] AFLP酶切连接 求高人指点啊 已有5人参与

最近做AFLP酶切连接的条件摸索，我用的是植物材料 DNA提取的结果OD260/280都在1.8左右，双酶切用的NEB的EcoRI 和Mse I，酶切分别做了1-6h的梯度，DNA加了400ng左右，没有做DNA的梯度，用的酶切体系是20微升的，但是酶切结果 跑电泳之后，隐隐约约能看到弥散，这几个时间没什么区别，上样量已经用了10微升，但还是看不出来什么，试着做了一下连接，之后做的PCR，结果如果，不知道酶切的问题究竟该怎么解决，连接产物跑电泳也很不理想，如图，请高人指导啊

PCR结果



酶切连接结果电泳图
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1楼 2011-11-29 20:09:10
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wskxbxf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by wskxbxf at 2011-11-29 20:09:10:
最近做AFLP酶切连接的条件摸索，我用的是植物材料 DNA提取的结果OD260/280都在1.8左右，双酶切用的NEB的EcoRI 和Mse I，酶切分别做了1-6h的梯度，DNA加了400ng左右，没有做DNA的梯度，用的酶切体系是20微升的，但 ...

没有高人指点 哎
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2楼2011-11-30 10:14:31
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7788945

银虫 (小有名气)
非高人想指点，但是。。
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3楼2011-11-30 11:05:16
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schkk

至尊木虫 (正式写手)
★
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PCR图是预扩增还是选择性扩增的结果啊？这个实验最后需要用大板的PAGE的测序胶作电泳的，琼脂糖分辩率不够，跑的效果基本也就这样了
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4楼2011-12-05 19:34:04
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wskxbxf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by schkk at 2011-12-05 19:34:04:
PCR图是预扩增还是选择性扩增的结果啊？这个实验最后需要用大板的PAGE的测序胶作电泳的，琼脂糖分辩率不够，跑的效果基本也就这样了

是预扩增的结果 我很困惑酶切连接的结果 求指点啊 不胜感激
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5楼2011-12-05 20:38:07
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xjtianying

新虫 (初入文坛)
★
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我也是初学者，我想问一下，你继续做选扩了没有，可以继续做选扩试试，选扩是要用大板的PAGE 跑的……看看结果怎么样

[ Last edited by xjtianying on 2011-12-5 at 21:34 ]
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6楼2011-12-05 21:33:23
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schkk

至尊木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
那你作选扩吧，应该没什么问题，预扩弥散的状态看着不错，等把选扩作完了上结果再分析吧，现在看不出来什么的，连接后电泳是没什么可看的，量太小了，除非你浓缩一下后再电泳
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7楼2011-12-05 21:55:16
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wskxbxf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xjtianying at 2011-12-05 21:33:23:
我也是初学者，我想问一下，你继续做选扩了没有，可以继续做选扩试试，选扩是要用大板的PAGE 跑的……看看结果怎么样
[ Last edited by xjtianying on 2011-12-5 at 21:34 ]

恩，最近准备做选择性扩增试试，结果到时候拿出来大家一起分享和讨论，我也是第一次做AFLP，以后有什么问题我们可以互相交流和沟通。
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8楼2011-12-06 10:12:54
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wskxbxf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by schkk at 2011-12-05 21:55:16:
那你作选扩吧，应该没什么问题，预扩弥散的状态看着不错，等把选扩作完了上结果再分析吧，现在看不出来什么的，连接后电泳是没什么可看的，量太小了，除非你浓缩一下后再电泳

谢谢指导，最近准备做选扩，到时候再分析一下。
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9楼2011-12-06 10:14:01
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yueyangyy85

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+4): 鼓励交流！欢迎常来！ 2011-12-21 18:59:50
不知道你的问题解决了么，植物基因组本身含的次生代谢产物比较多，一般酶切的时间两小时左右，时间太长效果也效果不明显，弥散的还是可以的。选择性扩增时，引物退火温度要适当低些，不然引物二聚体会比较明显！
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10楼2011-12-21 11:59:15
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