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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 测定β-半乳糖苷酶酶活为什么重复性差？？求高人指点
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dl19871205

银虫 (小有名气)

[交流] 测定β-半乳糖苷酶酶活为什么重复性差？？求高人指点

跟一公司申请的乳酸克鲁维酵母产β-半乳糖苷酶，测定酶活的方法如下：
1)在5mL离心管中加入1.8mL特定的缓冲液(50mM)，再加入100uL稀释到一定倍数的酶液，37oC下预热10min；
2)加入ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷，20mM)100uL后开始计时反应10min；
3)加入Na2CO3(1mol/L)1mL终止反应；
4)在420nm处测定吸光值，根据ONP(邻-硝基苯酚)标准曲线计算酶活；
酶活定义为：每分钟催化产生1μmol ONP的酶量为一个活力U。
测定酶活结果如下（单位：U/mL）：
3.88 、2.38 、4.55 、1.98 、3.84 、2.58
测了好多次了，但就是测不出好的重复性，现在实在找不到原因所在，求高人指点，本人将不胜感激！

[ Last edited by dl19871205 on 2012-3-10 at 14:25 ]
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1楼2012-03-10 14:20:45
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回帖置顶 ( 共有1个 )

schr_odinger

木虫 (小有名气)
★
dl19871205(金币+1): 谢谢参与
底物自身水解确实很烦人，我做的酶也是这个情况，郁闷啊~
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11楼2012-08-01 09:00:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

swqowen

金虫 (职业作家)
★
dl19871205(金币+1):谢谢参与
酶活实验有大量的误差，生物酶公司实验室一般控制平行试验误差为8%，所以，一般上我们普通实验室控制在15%之内还是可以的！我就是做这块的！:
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3楼2012-03-11 16:20:25
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dongxie1982

铜虫 (正式写手)
★
dl19871205(金币+1): 谢谢参与
个人认为是β-半乳糖苷酶的问题，可能活性不够稳定，之前也做过该实验，试剂全是新的，但老是做不出比较好的结果，换另外一家试剂公司的酶就好了，可以试试
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4楼2012-03-11 17:42:02
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biolio2009

木虫 (著名写手)
★
dl19871205(金币+1): 谢谢参与
你能不能把时间延长一下，这样测定的酶活估计就会比较稳定了，
还有就是这个酶的问题，换另外公司的产品
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6楼2012-03-12 08:39:34
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vvsober

木虫 (小有名气)
★
dl19871205(金币+1): 谢谢参与
我的重复性也很差。而且在PH6.5的缓冲液中，ONPG不到一个小时就自己水解了，还没加酶就已经变得黄黄的了。。。在PH4.5中就水解的不厉害。惆怅、、、
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7楼2012-03-12 14:33:51
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laicongxian

新虫 (初入文坛)
★
dl19871205(金币+1): 谢谢参与
为什么我用蒸馏水配制的ONPG过了一夜也没有颜色变化，是在sigma买的，难道是药品有问题吗？
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10楼2012-04-21 13:41:05
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月下白狼

新虫 (小有名气)
★
dl19871205(金币+1): 谢谢参与
师兄，我也要测这个酶的活性。但是以前我没接触过酶活的实验，你能把这个酶活的公式告我吗？谢谢你了!
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13楼2012-10-21 14:49:52
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mewlzhang

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到过这个问题，刚配制的ONPG基本无色，过了一夜甚至更长时间之后，会慢慢的变成淡黄色，这样的还能继续用吗？
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15楼2013-04-05 10:10:30
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dl19871205

银虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by mewlzhang at 2013-04-05 10:10:30
我也遇到过这个问题，刚配制的ONPG基本无色，过了一夜甚至更长时间之后，会慢慢的变成淡黄色，这样的还能继续用吗？

可以，扣除空白就可以了，尽量避光低温保存
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16楼2013-04-12 23:32:30
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dl19871205

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 月下白狼 at 2012-10-21 14:49:52
师兄，我也要测这个酶的活性。但是以前我没接触过酶活的实验，你能把这个酶活的公式告我吗？谢谢你了!

酶活公式都是自己定义的，而且不同的分光光度计测出来的误差也不一样，你还是按照步骤慢慢来吧
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17楼2013-04-12 23:33:29
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普通回帖

卷舒_ray

金虫 (小有名气)
★
dl19871205(金币+1):谢谢参与
帮你顶。
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2楼2012-03-10 18:55:32
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dl19871205

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卷舒_ray at 2012-03-10 18:55:32:
帮你顶。

可是我的酶活测出来相对误差好大啊，可以留个联系方式交流一下么？

[ Last edited by dl19871205 on 2012-3-11 at 22:17 ]
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5楼2012-03-11 22:16:31
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dl19871205

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by vvsober at 2012-03-12 14:33:51:
我的重复性也很差。而且在PH6.5的缓冲液中，ONPG不到一个小时就自己水解了，还没加酶就已经变得黄黄的了。。。在PH4.5中就水解的不厉害。惆怅、、、

测酶活用不了这么长时间吧？
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8楼2012-03-12 16:22:22
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dl19871205

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dl19871205 at 2012-03-11 22:16:31:
可是我的酶活测出来相对误差好大啊，可以留个联系方式交流一下么？

好的，我试试。
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9楼2012-03-12 16:23:11
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zhouxj

至尊木虫 (文坛精英)
★
dl19871205(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
3楼: Originally posted by swqowen at 2012-03-11 16:20:25
酶活实验有大量的误差，生物酶公司实验室一般控制平行试验误差为8%，所以，一般上我们普通实验室控制在15%之内还是可以的！我就是做这块的！:

定 确实是这样的
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14楼2012-10-21 15:47:29
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Eileenliao

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
onpg需要现配现用吗
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18楼2013-11-12 15:46:39
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strive12312312楼
2012-08-01 10:06   回复  
dl19871205(金币+1): 谢谢参与
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