应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切问题
121/2返回列表12下一页
查看: 2799  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wcx蜗牛

无虫 (小有名气)

[求助] 酶切问题

本人前期已近在T载体（买的由PUC18改造而成的）引入带有EcoRI和NcoI的目的片段，现在需再往上连片段。用EcoRI和NcoI双酶切之前构建好的T载体，电泳发现没有条带。接着我在体系中不加酶，加同样的buffer对照,电泳发现也没有条带。可以用同样的EcoRI和NcoI酶和buffer酶切pcr我要连接上的目的片段可以很好酶切。酶切质粒的量是足够的，5道中只上5ul质粒可以见条。双酶切是20ul质粒，3ulbuffer,1ul EcoRI,1ulNcoI,30ul体系。电泳时两个酶切体系60ul在一个孔道里电泳的，不见条带。如果说是buffer降解我的质粒，可是酶切pcr产物却未有问题。如果说没有切开，电泳应该有条带。
求高人指点。
图片说明： 从左往右，第2道1Kb marker,第3道双酶切T载体；第四道不加酶的对照；第5道原始T质粒；第六道空；第7道D2000marker;第8道pcr目的片段；第9道双酶切pcr目的片段

从左往右，第2道1Kb marker,第3道双酶切T载体；第四道不加酶的对照；第5道原始T质粒；第六道空；第7道D2000marker;第8道pcr目的片段；第9道双酶切pcr目的片段

[ Last edited by 1949stone on 2012-3-17 at 12:00 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-03-16 21:56:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-03-17 09:32:39
wcx蜗牛: 金币+2, ★有帮助 2012-03-17 09:39:21
建议重新转化你的含目的地片段的质粒重新提取质粒酶切,如果第3道双酶切T载体；第四道不加酶的对照都出自第5道原始T质粒估计很难解释,有可能胶孔漏了,重复一次可能就OK了
赞一下 回复此楼
2楼2012-03-17 00:08:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sunwei57 at 2012-03-17 00:08:02:
建议重新转化你的含目的地片段的质粒重新提取质粒酶切,如果第3道双酶切T载体；第四道不加酶的对照都出自第5道原始T质粒估计很难解释,有可能胶孔漏了,重复一次可能就OK了

谢谢你的回复，我重复过，几次都是这种情况，胶孔应该不会漏。
赞一下 回复此楼
3楼2012-03-17 09:40:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wcx蜗牛: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-03-17 11:39:02
电泳时间太长了了,最大的可能你上样量太多样品中的RNA 把胶中的EB全部结合,你染色应该能看到条带,酶切用20ul质粒很难切开太多了,我最多用2-3ul质粒(碱裂解法提取),电泳30-40分钟看看
赞一下 回复此楼
4楼2012-03-17 11:29:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sunwei57 at 2012-03-17 11:29:13:
电泳时间太长了了,最大的可能你上样量太多样品中的RNA 把胶中的EB全部结合,你染色应该能看到条带,酶切用20ul质粒很难切开太多了,我最多用2-3ul质粒(碱裂解法提取),电泳30-40分钟看看

我质粒浓度只有50ng/ul,浓度太低，故上样较多。
赞一下 回复此楼
5楼2012-03-17 11:38:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sunwei57 at 2012-03-17 11:29:13:
电泳时间太长了了,最大的可能你上样量太多样品中的RNA 把胶中的EB全部结合,你染色应该能看到条带,酶切用20ul质粒很难切开太多了,我最多用2-3ul质粒(碱裂解法提取),电泳30-40分钟看看

我EB不是加在胶中，是电泳完在用EB泡的，故应给不会出现RNA把胶中EB全部结合了。
赞一下 回复此楼
6楼2012-03-17 16:00:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wcx蜗牛: 金币+1 2012-03-19 09:57:08
点20ul质粒,溴酚兰出点样孔就看胶(5分钟左右),看看会有什么情况
赞一下 回复此楼
7楼2012-03-17 17:01:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王雨云

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wcx蜗牛: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2012-03-20 09:32:14
感觉从你的图中反应你先前构建的载体未成功。要不就是构建好的载体质粒都未提取出来，要不然3，4泳道怎么什么都没有。目的片段中是否含有其它两个常见的酶切位点，先把你认为构建好的载体提质粒，再用其它两个酶来切切看，可以看酶本身有木有问题，同时也可以看你的质粒中到底有木有你以前连接上去的片段。泳道里什么都没有，我觉得最大的可能还是压根儿都没提出质粒。些许拙见，仅供参考
赞一下 回复此楼
8楼2012-03-19 15:12:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 王雨云 at 2012-03-19 15:12:55:
感觉从你的图中反应你先前构建的载体未成功。要不就是构建好的载体质粒都未提取出来，要不然3，4泳道怎么什么都没有。目的片段中是否含有其它两个常见的酶切位点，先把你认为构建好的载体提质粒，再用其它两个酶来 ...

谢谢你的回复，问题的原因已近找到，正如同你所说，是我提得质粒浓度太低，经过酶切稀释后，电泳就没有了。
赞一下 回复此楼
9楼2012-03-20 09:29:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王雨云

金虫 (小有名气)
★ ★
西瓜: 金币+2, 没错，实验就要一步一步来~欢迎常来哈^_^ 2012-03-20 12:05:34
做实验就是这样，一点点小问题就可能影响很大，特别是平常看似做了很多遍的实验，总觉得不会出什么错误，其实不然。以前我们好多同学提完质粒都不检测质粒是否提出来了，浓度是否足够的，这样很容易给后续试验带来麻烦的，实验一旦出问题然后再去找原因就难了，一个结果可能是N种原因导致的，太痛苦了。虽然不干本行了，但还是偶尔上论坛看看有没有什么可帮忙的，工作中没能利用本专业知识，在论坛里发挥点余热，
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

wcx蜗牛
10楼2012-03-20 11:12:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wcx蜗牛 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[博后之家] 广西大学-广州大学招聘博士后 欢迎广大优秀人才！！！ +5 SCSIOyxguo 2026-09-03 8/400 2026-09-06 15:06 by 可爱小花朵
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 3/150 2026-09-06 13:09 by eObJPa4gWmp6
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 4/200 2026-09-06 12:49 by eObJPa4gWmp6
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 3/150 2026-09-06 12:49 by eObJPa4gWmp6
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 4/200 2026-09-06 12:29 by eObJPa4gWmp6
[找工作] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 7/350 2026-09-06 11:40 by eObJPa4gWmp6
[基金申请] 科研人应该花精力去思考如何解决问题，而不是去凝练问题 +10 瞬息宇宙 2026-09-01 19/950 2026-09-06 11:15 by jiangxuan2004
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 8/400 2026-09-06 11:09 by eObJPa4gWmp6
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 8/400 2026-09-06 11:00 by eObJPa4gWmp6
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-04 7/350 2026-09-06 11:00 by eObJPa4gWmp6
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 4/200 2026-09-06 07:20 by E1iiBLMU2XnD
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 7ZYIEW2YWn72 2026-09-04 9/450 2026-09-06 06:00 by E1iiBLMU2XnD
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +8 CRJ0Aq2FtVH0 2026-09-03 15/750 2026-09-06 05:48 by E1iiBLMU2XnD
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 5/250 2026-09-06 02:39 by E1iiBLMU2XnD
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 5/250 2026-09-06 02:19 by E1iiBLMU2XnD
[文学芳草园] 两块石头 +6 阿美_Lml888 2026-09-03 8/400 2026-09-05 13:52 by 阿美_Lml888
[文学芳草园] 初秋的晨风 +4 阿美_Lml888 2026-09-04 6/300 2026-09-05 13:51 by 阿美_Lml888
[硕博家园] Ei源刊怎么投 +4 Fengshun9711 2026-09-04 4/200 2026-09-04 19:30 by 研途知予
[硕博家园] 哈尔滨工业大学韩晓军教授课题组招收2027年硕士推免生及博士研究生 +3 灯灯灯灯DDDD 2026-09-03 3/150 2026-09-03 21:22 by 科研皮皮猪
[基金申请] 要骂人了，新模版改版就是要淡化问题凝练这种虚的东西，结果有个评委还在说凝练得不够 +9 瞬息宇宙 2026-08-31 17/850 2026-09-02 14:04 by anjeeshine
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭