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【求助/交流】单酶切酶和DNA的比例，体系大小的问题 已有5人参与
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酶切体系是越大越好吗？ 为什么我用EcoR I酶切，20ul体系加0.5ul酶的时候效果比200ul体系加2ul酶效果好？ 而且昨天用200ul体系切10ul的DNA没有切5ulDNA效果好 |
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空谷幽风
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西瓜(金币+5, EPI+1): 最近很给力啊！ 2011-04-14 12:06:23
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1.关于酶切体系：适当增加酶切体系是好的，因为限制性内切酶只有在自己的最适环境里才能完全发挥它的酶切能力，那么这个环境是由buffer来提供的，适当增大酶切体系可以减少因为移液枪精度或是个人操作所引起的实验误差，有利于限制性内切酶发挥其最大的酶切活性，但是由于增加酶切体系所随之带来的问题是限制性内切酶在体系当中浓度的降低，使得酶与酶切位点结合的几率也会有一定的下降；所以并非体系越大越好 2.关于酶切体系的确定：酶的用量是由底物的量来确定的，一般来讲1ul酶可以切割1ug的底物（最适条件下，1h）；由酶的量来确定酶切体系的大小，一般1ul酶对应20ul的酶切体系；由酶切体系确定buffer和水的量 3.关于根据酶的用量来确定酶切体系：酶切体系的确立是为了给酶提供一个最适的反应环境。酶都是保存在甘油里的（50%），而较高的甘油浓度对任何限制性内切酶的特异性切割都是不利的（产生星活性），正常情况下把酶稀释10倍后就可以忽略此因素的影响，再结合前面提到的适当增大酶切体系的原则，经过实践证明1ul酶对应20ul的酶切体系是个不错的选择 |
3楼2011-04-14 11:18:58
空谷幽风
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7楼2011-04-14 12:06:02
ben1147
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dhd997(金币+6): good 2011-04-14 13:56:58
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dhd997(金币+6): good 2011-04-14 13:56:58
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看你说的效果是指什么了，切割速度？切割是否完全？ 一方面，酶切也是化学反应，反应速度当然跟底物浓度相关，而且酶在稀溶液里的稳定性要差，过于稀的话可以考虑加点BSA。 另一方面，DNA纯度也影响切割，一般小提的质粒纯度都很差的，体系大一些相对好 另外EcoR I本身也比较特殊，酶多了不好 不过一般体系大小影响不会很明显，基本上是个人习惯。有的人就习惯用10 uL的小体系，我就不习惯用50 uL以下的体系。在样品、酶质量都好的情况下基本也不会出问题 |
2楼2011-04-14 11:05:30
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西瓜
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dhd997(金币+5): 继续努力 2011-04-14 13:57:18
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同一个体系的意思，是说里面各种成分的浓度一样。大体系、小体系，并不是说浓度不一样，而是说总的反应规模的大小。 大体系酶切，是因为酶切之后往往做胶回收等纯化，中间DNA损失比较多。所以开始切的DNA的量要多些（并等比例增加酶、buffer等成分），才能保证后续步骤有足量的DNA。 小体系连接，是因为连接产物需要量不多。转化的话，一点点连接产物就够了。所以，连接的DNA量不多，相应的buffer、酶用量就不多，就是说用小体系就足够了。 [ Last edited by 西瓜 on 2011-4-14 at 16:02 ] |
10楼2011-04-14 12:15:34
