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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】单酶切酶和DNA的比例，体系大小的问题
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starfishfly

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】单酶切酶和DNA的比例，体系大小的问题已有5人参与

酶切体系是越大越好吗？
为什么我用EcoR I酶切，20ul体系加0.5ul酶的时候效果比200ul体系加2ul酶效果好？
而且昨天用200ul体系切10ul的DNA没有切5ulDNA效果好
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1楼2011-04-14 10:58:50
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starfishfly

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-14 11:18:58:
1.关于酶切体系：适当增加酶切体系是好的，因为限制性内切酶只有在自己的最适环境里才能完全发挥它的酶切能力，那么这个环境是由buffer来提供的，适当增大酶切体系可以减少因为移液枪精度或是个人操作所引起的实 ...

十分感谢你及时而准确地回复，感觉我自己做了这么久都没有这几句话有用啊~~！！
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4楼2011-04-14 11:45:25
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starfishfly

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-14 11:18:58:
1.关于酶切体系：适当增加酶切体系是好的，因为限制性内切酶只有在自己的最适环境里才能完全发挥它的酶切能力，那么这个环境是由buffer来提供的，适当增大酶切体系可以减少因为移液枪精度或是个人操作所引起的实 ...

你好，我还有一个疑问~
平常说“大体系酶切，小体系酶连”这是因为在同等浓度的情况下，酶反应的空间问题吗？大体系有助于酶与DNA各个位点的识别，小体系有助于连接片段间的碰撞？
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5楼2011-04-14 11:49:52
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starfishfly

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2011-04-14 11:05:30:
看你说的效果是指什么了，切割速度？切割是否完全？
一方面，酶切也是化学反应，反应速度当然跟底物浓度相关，而且酶在稀溶液里的稳定性要差，过于稀的话可以考虑加点BSA。
另一方面，DNA纯度也影响切割，一般小 ...

我切的是基因组DNA，效果是说切割是否完全~~
另外酶切的时间有没有什么影响呢？
我切了5hr的反而比10hr的更完全呢~~
谢谢你哦~~~
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6楼2011-04-14 11:52:57
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starfishfly

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-14 12:07:46:
不要无限的去延长酶切时间，任何限制性内切酶酶切时间久了都会出现星活性，在不该酶切的位置出现了非特异性切割，一般切2h就够了

我是切基因组DNA的，一直切不断，只好延长时间了的。
如果出现星活性的话，应该是条带增多吧，我跑出来的电泳图谱是  时间短的更弥散 同一管酶切，不同时间取样的
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11楼2011-04-14 12:24:27
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starfishfly

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-14 12:48:30:
能跟我透漏下你切基因组DNA做什么实验吗？

是做subclone的~
我开始切了一批筛到的重组体是假阳性的，因为那时候切的效果不好，DNA很多都没切出来。前天切的本来挺好的，但酶连电转后什么都没长……我昨天又切，就多加了5ul的DNA就根本一点也切不开了。
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14楼2011-04-14 13:00:38
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