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qianggene

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酶切问题求助！！！已有10人参与

各位虫友，小妹有一问题请教，我最近酶切质粒（PMD-18T)总是切的相当不好，不是切不开，而是切开的目的带特别弱，但质粒很亮，是我加的质粒浓度太高了吗，但我保证加的量是小于1微克。我用的酶是ASCI和NCOI，请高手指点，不胜感激！
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1楼2010-05-11 20:13:16
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lingn

木虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2):good！ 2010-05-11 20:39:10
qianggene(金币+1): 2010-05-12 14:53:57
首先，质粒的纯度很重要，如果质粒提的不好，含有太多的蛋白是会影响酶切效果的。
可以适当的放大体系，延长酶切时间，或者多加点酶。
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2楼2010-05-11 20:31:11
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
amisking(金币+1):good！ 2010-05-13 08:01:01
不知道楼主提完质粒有没有纯化一下~
还有就是酶切的话按照黄金比例添加就行了~
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2010-05-11 21:19:00
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
qianggene(金币+1): 2010-05-12 14:53:47
不知道楼主目的片段是多大？可能目的条带与载体大小太悬殊了。如果这样，等摩尔情况下，即使全部切开，目的条带也很弱。
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Thank-you，so-blue.
4楼2010-05-11 21:25:05
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todouhy

铜虫 (小有名气)
我想问一下啊，黄金比例是什么意思啊？酶切的时候DNA的量和酶的量的比例，谢谢啊！
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5楼2010-05-11 21:44:57
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yinsongna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2010-05-11 21:19:00:
不知道楼主提完质粒有没有纯化一下~
还有就是酶切的话按照黄金比例添加就行了~

黄金比例是什么啊
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6楼2010-05-11 22:35:47
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yinsongna

金虫 (正式写手)
qianggene(金币+1): 2010-05-12 14:54:24
质粒可以测一下OD值，确定加的质粒浓度及蛋白污染程度
不知道楼主的酶切体系是多大，可以用10 ul体系切试试
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7楼2010-05-11 22:37:42
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
qianggene(金币+1): 2010-05-12 14:55:30
50ul的体系
10*buffer 5ul
酶 1-2ul
DNA <=2ug
去离子水补至50ul
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2010-05-12 10:50:26
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
qianggene(金币+1): 2010-05-12 14:54:16
xx微升体系就不用讨论了……浓度配比才是最关键的，而不是体积
楼主可以想象一下，1ug质粒，假设6~8kb，你的目的基因占了1kb，那么切下来之后目的基因会是多少ug？
明白我想讲什么意思了吧
参考4楼的意见吧
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9楼2010-05-12 13:08:32
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qianggene

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lingn at 2010-05-11 20:31:11:
首先，质粒的纯度很重要，如果质粒提的不好，含有太多的蛋白是会影响酶切效果的。
可以适当的放大体系，延长酶切时间，或者多加点酶。

请问如果适当多加点酶会不会破坏了体系的比例，加酶的量是个范围吗？
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10楼2010-05-12 14:57:30
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