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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒pPICZA酶切问题
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qingsong35

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】质粒pPICZA酶切问题 已有3人参与

请问有人用过SacII和PmlI对pPICZA进行过双酶切吗？我用的是NEB的酶，用SacII和PmlI双酶切质粒pPICZA和PCR产物（1Kb），酶切缓冲液和质粒的量都严格按照说明书进行，并切了12h。然后进行连接转化，提取转化子质粒发现这些转化子都是假阳性，提取出的质粒的大小与载体pPICZA相当，这应该是载体自连导致的。请问是不是用SacII和PmlI很难将pPICZA酶切干净？谢谢
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1楼 2010-05-19 14:29:16
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hyw1989960

木虫 (正式写手)

快乐家族二十八
★
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你不要告诉我，你酶切后没回收，就连接了，酶切后要将载体片段回收再连接。。。。双酶切载体基本上不自连。。
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快乐家族
2楼2010-05-19 14:37:28
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zestyhuan

新虫 (初入文坛)
★ ★
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lstt09nk(金币+1):欢迎新虫多多交流~~ 2010-05-19 16:32:26
双切不行可试试分步切，不过要回收两次可能损失较大。一般双切粘末端的话还是比较好连接的。
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3楼2010-05-19 16:27:17
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qingsong35

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hyw1989960 at 2010-05-19 14:37:28:
你不要告诉我，你酶切后没回收，就连接了，酶切后要将载体片段回收再连接。。。。双酶切载体基本上不自连。。

呵呵，那怎么可能不回收就去连接呢。载体和PCR产物酶切12h后，利用QIAGENE的试剂盒进行纯化，然后才去连接的。切了那么久还是自连，郁闷啊
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4楼2010-05-19 21:50:50
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qingsong35

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zestyhuan at 2010-05-19 16:27:17:
双切不行可试试分步切，不过要回收两次可能损失较大。一般双切粘末端的话还是比较好连接的。

唉，只能试试分步酶切了。那两个酶一个是产生平末端，一个是粘性末端，要是载体被两个酶切了不应该会自连啊请教一下，那我的PCR产物是不是也应该要分步去切呢？

[ Last edited by qingsong35 on 2010-5-19 at 21:59 ]
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5楼2010-05-19 21:53:24
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zestyhuan

新虫 (初入文坛)
★
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一端平一端粘是不太好连的，我做过粘端补平后一平一粘的连接，我的连接方法是连接前载体和目的片段65度10分，冰上1分后加连接酶16度过夜的。根据载体和目的片段的浓度调整连接的量。你的PCR产物不连T载体吗？
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6楼2010-05-20 10:16:06
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