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qingsong35

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】质粒pPICZA酶切问题 已有3人参与

请问有人用过SacII和PmlI对pPICZA进行过双酶切吗?我用的是NEB的酶,用SacII和PmlI双酶切质粒pPICZA和PCR产物(1Kb),酶切缓冲液和质粒的量都严格按照说明书进行,并切了12h。然后进行连接转化,提取转化子质粒发现这些转化子都是假阳性,提取出的质粒的大小与载体pPICZA相当,这应该是载体自连导致的。请问是不是用SacII和PmlI很难将pPICZA酶切干净?谢谢
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zestyhuan

新虫 (初入文坛)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎新虫多多交流~~ 2010-05-19 16:32:26
双切不行可试试分步切,不过要回收两次可能损失较大。一般双切粘末端的话还是比较好连接的。
3楼2010-05-19 16:27:17
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hyw1989960

木虫 (正式写手)

快乐家族二十八


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你不要告诉我,你酶切后没回收,就连接了,酶切后要将载体片段回收再连接。。。。双酶切载体基本上不自连。。
快乐家族
2楼2010-05-19 14:37:28
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qingsong35

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by hyw1989960 at 2010-05-19 14:37:28:
你不要告诉我,你酶切后没回收,就连接了,酶切后要将载体片段回收再连接。。。。双酶切载体基本上不自连。。

呵呵,那怎么可能不回收就去连接呢。载体和PCR产物酶切12h后,利用QIAGENE的试剂盒进行纯化,然后才去连接的。切了那么久还是自连,郁闷啊
4楼2010-05-19 21:50:50
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qingsong35

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by zestyhuan at 2010-05-19 16:27:17:
双切不行可试试分步切,不过要回收两次可能损失较大。一般双切粘末端的话还是比较好连接的。

唉,只能试试分步酶切了。那两个酶一个是产生平末端,一个是粘性末端,要是载体被两个酶切了不应该会自连啊请教一下,那我的PCR产物是不是也应该要分步去切呢?

[ Last edited by qingsong35 on 2010-5-19 at 21:59 ]
5楼2010-05-19 21:53:24
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