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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【问题反馈】质粒双酶切切下120bp每次都看不到？
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)

[交流] 【问题反馈】质粒双酶切切下120bp每次都看不到？ 已有18人参与

质粒6800bp,双酶切后切下120bp,每次跑电泳都看不到120的条带。另外一条大的条带很亮，是不是没有切开呢，反正用于下步连接也不出结果，不吝赐教！
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1楼 2010-09-14 23:23:43
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
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lstt09nk(金币+1):感谢回复~ 2010-09-15 09:41:54
应该是量太小了，给你计算了下，小片段120 bp，要看到的话，至少要20 ng（相当于5uL maker中弱带的亮度），酶切时6800 bp的大片段和120 bp的小片段摩尔数是一样的，这样的话，计算下来，你想看到120 bp的小片段，至少要切1.2 ug以上的载体，这个量需求还是比较大的。
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Thank-you，so-blue.
7楼2010-09-15 09:37:22
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zdmei

金虫 (小有名气)
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电泳点个质粒作对照，闭合环状的质粒和切开的是有差别
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9楼2010-09-15 12:54:23
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zplipeng

金虫 (著名写手)
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对，应该是量太少了，可以找找其他酶切位点，把片段切的长一点。或者加大质粒的量，或者做pcR验证，同时加上没有目的条带的质粒做阴性对照。。。
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加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~
5楼2010-09-15 09:06:15
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feiye2214

木虫 (正式写手)
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lstt09nk(金币+1):鼓励交流，欢迎常来~ 2010-09-15 00:07:18
是不是胶太短了，6800：120，估计你的120的都跑到缓冲液里了
最好上个图看看
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2楼2010-09-14 23:27:01
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)
应该没有，marker100bp还可以看的到的。我认为就是量太小了，所以看不到120bp的条带。
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3楼2010-09-15 08:55:15
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zhaohui-eric

木虫 (著名写手)
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Originally posted by wwdxx2004 at 2010-09-15 08:55:15:
应该没有，marker100bp还可以看的到的。我认为就是量太小了，所以看不到120bp的条带。

这个可能行比较大
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4楼2010-09-15 08:59:43
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lu_zl

银虫 (小有名气)
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lstt09nk(金币+1):鼓励交流~ 2010-09-15 09:42:10
EB的发光强度与片段大小是成正比的。片段越大，插入的EB越多，越容易观察到。同样mol的小片段当然就看不到。所以加大质粒的量，顺便加大酶量，延长酶切时间，都可以改善。
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6楼2010-09-15 09:35:11
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sfxt001

木虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-09-15 09:37:22:
应该是量太小了，给你计算了下，小片段120 bp，要看到的话，至少要20 ng（相当于5uL maker中弱带的亮度），酶切时6800 bp的大片段和120 bp的小片段摩尔数是一样的，这样的话，计算下来，你想看到120 bp的小片段， ...

这个正解
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8楼2010-09-15 10:58:10
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feiye2214

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by zdmei at 2010-09-15 12:54:23:
电泳点个质粒作对照，闭合环状的质粒和切开的是有差别

说的也是
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10楼2010-09-15 13:50:34
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