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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提取的质粒跑出四条或者五条带，但酶切后只有一条带，是不是我的质粒污染了
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kjxyzxh001

铜虫 (小有名气)

[求助] 提取的质粒跑出四条或者五条带，但酶切后只有一条带，是不是我的质粒污染了已有1人参与

各位大虫，小弟最近扩增质粒，出现了怪现象，我的质粒转化的DH5a，挑取单克隆，再摇菌，提取质粒，跑胶发现质粒有很多条带，四条或者五条，就算是有超螺旋的和线性的，算起来也只有三条，不可能有四五条啊。我用BamH1 酶切（只有一个酶切位点），发现只有一条带。用EcoR1 酶切（只有一个酶切位点），也是一条带，用Sal 1 酶切（该质粒中无此酶酶切位点），发现切不开，条带和跑质粒一样。如果污染了其他质粒的话，用三种酶至少应该有个酶能切开污染的质粒吧，但都没发现杂带。如果没有污染其他质粒的话，质粒跑出来最多也是三条带啊，我这怎么出现了四五条。纠结啊…………，请各位给指点一二！
图片中 P：质粒，大约5000bp。
       Bam：BamH1酶切质粒
       Sal:    Sal1 酶切质粒
       Eco：EcoR1酶切的质粒
两个方框是单独挑取的两个菌落分别提的质粒。最左边和中间的是Marker5000。

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1楼2012-04-10 11:27:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从你的描述来看，不应该是污染，就是你制备质粒时不小心（没有严格按照试剂盒的建议，该轻柔的就该轻柔），导致质粒中包含多种形式，其实，这种情况比较常见，但也意味着你的质量不太好。
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6楼2012-04-10 20:28:06
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kjxyzxh001

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小婧子zj at 2012-04-10 17:08:29:
单酶切的话，不应该大小一样吗？为啥你的酶切条带大小不一样呢？

方框里面是同一个质粒酶切的，BamH1 和EcoR1 条带大小是一直的
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7楼2012-04-11 19:51:37
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普通回帖

kjxyzxh001

铜虫 (小有名气)
图中质粒的泳道，能明显看出五条带啊（箭头指示）
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2楼2012-04-10 11:30:43
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-10 18:37:35
嗯...............
我也有跑出来五条带过，怀疑是提质粒时，gDNA污染，不过也觉得没有关系，转化时gDNA又不会转进去，况且后面还要再鉴定，你拿三个内切酶去做了鉴定，我这么干的话要是偶老板知道了....下场就惨了，所以个人看法，没有其他质粒污染的。
祝实验顺利 若有说错希望高手指点
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Let God do with it as He wills
3楼2012-04-10 11:41:00
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kjxyzxh001

铜虫 (小有名气)
呵呵，谢啦，实验室别的不多，内切酶还够用。请问如果是gDNA 污染的话，那么我拿这个质粒再次转化，再次提起质粒的话，会不会就会消除这些多余的带呢？
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4楼2012-04-10 14:54:39
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小婧子zj

金虫 (小有名气)
单酶切的话，不应该大小一样吗？为啥你的酶切条带大小不一样呢？
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5楼2012-04-10 17:08:29
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好的验证方法就是做一个单酶切或者双酶切。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2012-04-11 20:12:36
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)

蓝博士

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做一个单酶切或者双酶切试试看吧。
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蓝精灵
9楼2012-04-11 20:43:33
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小婧子zj

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-04-10 20:28:06:
从你的描述来看，不应该是污染，就是你制备质粒时不小心（没有严格按照试剂盒的建议，该轻柔的就该轻柔），导致质粒中包含多种形式，其实，这种情况比较常见，但也意味着你的质量不太好。

但是两个都和质量大小不一致呀
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10楼2012-04-12 10:23:08
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