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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒提取有白色沉淀，跑胶却没条带，啥原因？
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)

[交流] 质粒提取有白色沉淀，跑胶却没条带，啥原因？

质粒提取有白色沉淀，干燥后几乎透明，加30微升的灭菌水溶的，5微升跑胶，却是白板，啥原因？
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1楼 2012-07-30 11:14:46
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)
amisking: 回帖置顶 2012-07-30 20:12:23
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-30 12:07:54
楼主可以把你的操作步骤发上来才好分析，跑胶没有带只能说明没提出质粒来。

2、取培养好的菌液1.5ml至EP管中，10,000r/min离心60s,弃上清;
3、加入100μl预冷的Solution I，剧烈震荡混匀；
4、加入200μl新配置的SolutionII,轻柔滚动EP管直至管中菌体溶液呈透明，冰水浴3~5min;
5、加入150μl预冷的SolutionIII,轻柔颠倒混匀，冰水浴5~10min，12,000r/min 离心15min,弃沉淀，将上清移入另一新EP管中；
6、加入等体积氯仿，轻柔颠倒混匀，10,000r/min 离心15min,取上清液体于另一新EP管中；
7、加入0.1V的醋酸钠，2V的无水乙醇，反复颠倒混匀，于-80℃沉淀20~30min，12,000r/min 离心15min;
8、弃上清，将EP管倒扣吸水纸上，直至EP管中液体流尽；
9、将沉淀放置在真空冷冻干燥机中干燥3~5min;
10、加入20~30μl ddH2O。
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6楼2012-07-30 12:10:46
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青梅煮酒17

新虫 (初入文坛)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励积极交流经验 2012-08-08 14:24:06
其实出现这个问题有可能是非常简单的小细节，实验室之前出现这种情况（本人的样品之前确定是正常的，同样重新提取别人带跑样品是就是没东西。后来自己重新爬一次电泳正常。）原因很简单：DNA沉淀未充分溶解。这虽然说是比较低级的错误，但是在使用真空干燥比较容易出现。楼主在使用真空干燥好最好不要过分干燥，在沉淀挥发完乙醇之后还保持潮湿就溶解较好。（溶解得教好，DNA也不易被破坏）。建议室温放置一段时间，以挥发干乙醇为宜。
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13楼2012-08-07 23:52:10
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普通回帖

zc10052157

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
质粒提取里面有干燥  灭菌水溶的步骤吗？
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2楼2012-07-30 11:21:20
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gelois

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你提的质粒是很大的那种吗？当初我提Bacmid的时候出现过这样的情况。你异丙醇沉淀之后用70%的乙醇洗了么？
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3楼2012-07-30 11:31:08
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chenguestc

木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主可以把你的操作步骤发上来才好分析，跑胶没有带只能说明没提出质粒来。
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4楼2012-07-30 12:07:54
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gelois at 2012-07-30 11:31:08
你提的质粒是很大的那种吗？当初我提Bacmid的时候出现过这样的情况。你异丙醇沉淀之后用70%的乙醇洗了么？

2倍无水乙醇沉淀，70%的乙醇洗了
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5楼2012-07-30 12:08:10
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xiongyaoling

金虫 (小有名气)
★
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我们一般用试剂盒提的，很好用的
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7楼2012-07-30 13:26:07
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NightXH

新虫 (初入文坛)
★
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我用的步骤只最后一步不同，是0。1×TE溶解，不过应该也没大问题，另外，不知道你用的是什么胶？我用的是0.7%琼脂糖，220v跑了一下午，才跑出一小块距离，你确定你的胶没问题？浓度、电压、时间？
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8楼2012-07-30 15:43:58
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eiieen

新虫 (小有名气)
★
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楼主 真空干燥前有白色沉淀吗？
哪一步 没看到白色沉淀
测一下 260/280nm OD
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9楼2012-07-30 16:25:20
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chenguestc

木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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uuu555000: 金币+5 2012-07-30 21:14:12
引用回帖:
6楼: Originally posted by uuu555000 at 2012-07-30 12:10:46
2、取培养好的菌液1.5ml至EP管中，10,000r/min离心60s,弃上清;
3、加入100μl预冷的Solution I，剧烈震荡混匀；
4、加入200μl新配置的SolutionII,轻柔滚动EP管直至管中菌体溶液呈透明，冰水浴3~5min;
5、加入1 ...

从操作上看没有问题。在培养菌液之前有检测嘛？就是鉴定你的克隆是包含你的质粒的。如果有，就只有再重提一遍看。
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10楼2012-07-30 20:20:26
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
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换试剂盒吧，这样比啥都方便，估计是试剂盒或者样品的问题
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11楼2012-07-30 23:02:47
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
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会不会只是蛋白污染呢？
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12楼2012-07-31 12:40:32
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朝着江河走

金虫 (小有名气)
★
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根本就没有质粒，透明的物质可能是蛋白吧
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14楼2012-08-08 17:20:25
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小懒爱斯德

新虫 (初入文坛)
★
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楼主，你提的是什么菌？质粒大概多大？拷贝数多少？
我也遇到这种情况~那个透明的很难溶，应该不是或不全是DNA~
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15楼2012-10-31 11:30:11
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lv4xx

铜虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
10楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-30 20:20:26
从操作上看没有问题。在培养菌液之前有检测嘛？就是鉴定你的克隆是包含你的质粒的。如果有，就只有再重提一遍看。...

请问如何对菌液进行检测？
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16楼2012-11-23 11:32:05
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chenguestc

木虫 (职业作家)
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引用回帖:
16楼: Originally posted by lv4xx at 2012-11-23 11:32:05
请问如何对菌液进行检测？...

转化后，涂板，挑单克隆小量培养，培养后,取1UL 作模板用你的特异引物和通用引物同时做菌落PCR检测。
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17楼2012-11-26 08:20:48
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)
★
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你可能干燥时间长了，DNA没有溶解出来。
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18楼2012-11-26 11:44:43
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jane66226431

新虫 (初入文坛)
★
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我也做过也出现可能质粒没提出来，配置菌液浓度低了！
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19楼2013-11-19 09:38:39
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逍遥e宝

铁杆木虫 (正式写手)
★
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我一般用tris-酚：氯仿：异戊醇=25：24:1除蛋白的。3次重复，效果很好，最后沉淀是透明的，用TE溶解可能会好点。
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20楼2013-11-19 23:11:46
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乌和尚

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
估计是试剂盒或者样品的问题
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21楼2014-01-29 22:25:32
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们实验室质粒提取的一大坨白色沉淀是RNA，老板让要求我们必须加RNase （0.1%）37度消化1小时后，异丙醇沉淀纯化后才能送测序。
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22楼2014-01-30 23:28:01
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有可能是70%酒精洗的时候洗掉了。问下，制胶加EB了吗？
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23楼2014-02-18 17:19:28
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liu123kuan

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到的是这种情况，你每个样品都有平行吗？
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24楼2015-10-22 20:54:57
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wxb2061

银虫 (小有名气)
我们是20微TR溶

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25楼2015-10-22 23:59:40
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