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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因组提取过程中加入溶菌酶有白色沉淀
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小嫩瓜

木虫 (小有名气)

[求助] 基因组提取过程中加入溶菌酶有白色沉淀

细菌基因组提取加入溶菌酶后产生白色沉淀 试剂盒说明书要求37度水浴30-60min,我都水浴了三个小时了还是没啥动静？求原因

[ Last edited by 1949stone on 2011-9-29 at 11:43 ]
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活的艰辛是因为执着和不放弃
1楼 2011-09-24 17:53:10
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bear0329

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

小嫩瓜(金币+1): 2011-09-26 11:41:45
你是在哪一步加的溶菌酶呢
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以马内利！
2楼2011-09-26 09:58:21
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小嫩瓜

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bear0329 at 2011-09-26 09:58:21:
你是在哪一步加的溶菌酶呢

第一步，菌液离心去上清后加入溶菌酶。
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活的艰辛是因为执着和不放弃
3楼2011-09-26 11:42:28
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bear0329

金虫 (正式写手)
那你打电话问下试剂盒公司的技术看看哦
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以马内利！
4楼2011-09-27 09:19:17
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shuixian2009

木虫 (知名作家)

优秀版主

【答案】应助回帖

小嫩瓜(金币+1): 2011-09-28 13:59:29
确定TE缓冲液没问题吧，溶菌酶的终浓度是多少？
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告别绝望 告别风中的山谷 哭是一种幸福
5楼2011-09-28 10:34:53
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小嫩瓜

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by shuixian2009 at 2011-09-28 10:34:53:
确定TE缓冲液没问题吧，溶菌酶的终浓度是多少？

缓冲溶液是以前试剂盒里带的，后来又问同学借了点。溶菌酶终浓度差不多40mg/mL.现在倒是不出现沉淀了，就是提不出来。
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活的艰辛是因为执着和不放弃
6楼2011-09-28 14:01:54
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shuixian2009

木虫 (知名作家)

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小嫩瓜(金币+1): 2011-09-29 10:56:00
dhd997(金币+5): good 2011-09-29 15:12:07
西瓜(MolEPI+1): 这个可以有~ 2011-09-29 18:33:21
我提基因组时用的试剂盒是OMEGA的，酶的缓冲液是自己配的TE缓冲液，溶菌酶的浓度是5mg/ml,时间一般是30-60min。 这是之前的实验步骤：
1．室温下，转移≤3 mL培养液于1.5 mL干净离心管，4000 rpm离心10 min收集细菌；
2．尽量倒去培养基，加入180 μL TE缓冲液完全悬浮细菌，再加入20μL 50 mg/mL溶菌酶混匀后放于30 ℃孵育30 min；
3．室温下以4000 rpm离心5 min收集已消化细胞壁的细菌，弃上清；
4．加入200 μL BTL溶液重悬细胞，革兰氏阳性菌，加入25～40 mg玻璃珠，涡旋5 min，以使细胞壁充分裂解；
5. 加25 μL蛋白酶K（15mg/mL），涡旋混匀，于55 ℃恒温水浴锅中孵育至细菌完全裂解，每20~30 min涡旋振荡样品一次，一般在1小时之内就可消化完全；
6．加入5 μL RNA酶，并在室温下放置5 min；
7．加入220 μL BDL，涡旋混匀，并在65 ℃下水浴10 min；
8．加入220 μL无水乙醇并充分地涡旋振荡；
9．将Hibind柱置于2 mL收集管上,将第8步得到的样品（包括可能形成的所有沉淀）全部转移到柱子内，10,000 rpm离心1 min以结合DNA，弃去流出液和收集管；
10．把柱子装到一新的2 mL收集管上，加入500 μL HB，10,000 rpm离心1 min，弃过滤液；
11．  加入750 μL DNA Wash Buffer（已用无水乙醇稀释）于柱子中，10,000 rpm离心1 min以洗涤柱子，弃去流出液，收集管再继续下一步使用；
12．柱子重新套回2 mL收集管，加入750 μL DNA Wash Buffer，10,000 rpm离心1 min以洗涤柱子，弃去流出液。 柱子重新套回2 mL收集管，≥10,000 rpm离心空柱2 min以甩干柱子；
13．把柱子置于新的1.5 mL离心管中，加入60 μL 65 ℃预热的DNA Elution Buffer至柱子的膜中央，65 ℃下放置1 min；
14．室温下，10,000 rpm离心1 min从柱子上洗脱出DNA。另取60 μL预热的 DNA Elution Buffer再洗脱一次。加入洗脱液后，将柱子放置于65 ℃，水浴1~2分钟，10,000 rpm离心1 min。离心管内即为提取的基因组DNA，保存在-20 ℃以防止降解；
15．DNA的产量及纯度由紫外分光光度计检测，将提取的DNA取少量做适当稀释，用双蒸水作空白对照，通过比较在260 nm和280 nm处的吸光度估计得到DNA的质量。
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告别绝望 告别风中的山谷 哭是一种幸福
7楼2011-09-28 19:12:55
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frankerry

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小嫩瓜(金币+1): 2011-09-29 10:54:06
dhd997(金币+3): good 2011-09-29 15:12:15
如果严格按照试剂盒说明书提取的话，提不出来我分析以下原因：
1.考虑菌体量是否足够。
2.试剂盒中溶菌酶等需要在冷冻保存的试剂是否按要求保存，确保你所加试剂成分有效。最好不要用过期的试剂盒试剂
3.最后就是你的菌体如果量足够的话，破壁除了加入足量溶菌酶还可以辅助一些物理的或机械手法。如反复冻融几次，不要太剧烈的震荡几次等。
一般情况下，细菌DNA比较好提。夸张点说，不用溶菌酶都可以。呵呵祝你好运！
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8楼2011-09-29 08:58:20
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asznpb

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

小嫩瓜(金币+1): 2011-09-29 10:56:06
有沉淀很正常啊，加入蛋白酶K之后55℃震荡30-60min后才会出现蛋清状……
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显微镜下的世界很精彩！
9楼2011-09-29 09:54:43
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小嫩瓜

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by frankerry at 2011-09-29 08:58:20:
如果严格按照试剂盒说明书提取的话，提不出来我分析以下原因：
1.考虑菌体量是否足够。
2.试剂盒中溶菌酶等需要在冷冻保存的试剂是否按要求保存，确保你所加试剂成分有效。最好不要用过期的试剂盒试剂
3.最后就 ...

恩，非常感谢
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活的艰辛是因为执着和不放弃
10楼2011-09-29 10:54:39
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